Для чего необходимы поры в ядре. Молекулярная организация клеточного ядра. Механизм экспорта белков из ядра

Ядро, его строение и биологическая роль.

Ядро состоит из 1)поверхн аппарата ядра (в нем выдлел: 2 мембраны, перинуклеарн пространств, поровые комплексы, ламину.) 2) кариоплазмы (нуклеоплазмы) 3) хроматина (в нём эухроматин и гетерохроматин) 4) ядрышка (грануляр и фибриляр компонент.)

Ядро – это структура клетки которая выполняет функцию хранения и передачи инф, а так же регулирует все жизненные процессы клетки. Ядро несёт в себе генетическую (наследственную) инф в виде ДНК. Ядра обычно имеют шаровидную или яйцевидную форму. Я. окружено ядерн оболочкой. Ядерная оболочка пронизана ядерными порами. Через них ядро обменивается веществами с цитоплазмой(внутр средой клетки). Наружная мембрана переходит в эндоплпзматич ретикулум и может быть усеяна рибосомами. Отношение размеров ядра и клетки зависит от функциональной активности клетки. Большинство клеток одноядерные. Двуядерными могут быть кардиомиоциты. Всегда двуядерны инфузории. В них характерен ядерный дуализм.(то есть ядра различ по строению и финкциям). Малое ядро (генеративное) – диплойдное. Оно обеспечивает только половой процесс у инфузорий. Большое (вегетативное) ядро полиплойдное. Оно регулирует все остальные жизненные процессы. Многоядерными бывают клетки некоторых простейших и клетки скелетной мускулатуры.

П.А.Я. или кариотека ) имеет микроскопическую толщину и поэтому виден в световой микроскоп. Поверхностный аппарат ядра включает:

а)ядерную оболочку, или кариолемму;. б)паровые комплексы; в)периферическую плотную пластинку (ППП), или ламину.

(1) Ядерная оболочка (кариолемма). состоит из 2 мембран - наружной и внутренней, разделён­ных перинукляеарным пространством. Обе мембраны имеют такое же жидкосто-мозаичное строе­ние, как и плазматическая мембрана, и различаются по набору белков. Среди этих белков имеются ферменты, пере­носчики и рецепторы. Наружная ядерная мембрана является продолжением мембран грЭПС и может быть усеяна рибосомами, на которых идёт синтез белка. Со стороны цитоплазмы наружная мембрана окружена сетью промежуточных (ви-ментиновых) фипаментов. Между наружной и внутренней мембранами находится перинуклеарное пространство -полость шириной 15-40 нм, содержимое которого сообщается с полостями каналов ЭПС. По составу перинуклеарное пространство близко к гиалоплазме и может содержать синтезированные рибосомами белки. Главная функция кариолеммы - изоляция гиалоплазмы от кариоплазмы. Специальные белки ядерных мембран, расположенные в облас­ти ядерных пор, осуществляют транспортную функцию. Ядерная оболочка пронизана ядерными порами, через которые осуществляется связь кариоплазмы и гиалоплазмы. Для регуляции такой связи в порах находятся (2) поровые комплексы. Они занимают 3-35% поверхности ядер­ной оболочки. Число ядерных пор с поровыми комплексами является изменчивой величиной и зависит от активности ядра. В области ядерных пор наружная и внутренняя ядерные мембраны сливаются. Со­вокупность структур, связанных с ядерной порой, называется комплексом ядерной поры. Типичный поровый ком­плекс представляет собой сложную белковую структуру - содержит более 1000 молекул белка. В центре поры рас­положена центральная белковая глобула (гранула), от которой по радиусу отходят тонкие фибриллы к перифериче­ским белковым глобулам, образуя диафрагму поры. По периферии ядерной поры находятся две параллельные коль­цевые структуры диаметром 80-120 нм (по одному с каждой поверхности кариолеммы), каждое из которых образо­вано 8 белковыми гранулами (глобулами).

Белковые глобулы перового комплекса подразделяются на центральные и пе­риферические . С помощью периферических глобул осуществляется транспорт макромолекул из ядра в гиалоплазму. (фиксируются в мем­бране специальным интегральным белком. От этих гранул к центру сходятся белковые фибриллы, формирующие пе­регородку - диафрагму поры)

В нем участвуют специальные белки периферических глобул - нуклеопорины. В периферических глобулах имеется особый белок - переносчик молекул т-РНК

Центральная глобула специализируется на транспорте и-РНК из ядра в гиалопдазму. В её составе имеются ферменты, участвующее в химической модификации иРНК - ее процессинге.

Гранулы поровых комплексов структурно связаны с белками ядерной ламины, которая участвует в их организации

Функции комплекса ядерной поры:

1. Обеспечение регуляции избирательного транспорта в-в между цитоплазмой и ядром.

2. Активный перенос в ядро белков

3. Перенос в цитоплазму субъединиц рибосом

(3) ППП или ламина

слой толщиной 80-300 нм. прилегает изнутри к внутренней ядерной мембране. Внутренняя ядерная мембрана гладкая, ее интегральные белки связаны с ламиной (периферической плотной пластинкой). Ламина состоит из специальных переплетенных белков-ламинов, образующих периферический кариоскелет. Белки-ламины относятся к классу промежуточных филаментов (скелет­ных фибрилл). У млекопитающих известно 4 вида этих белков - это ломимы А, В, В 2 и С. Эти белки поступают в яд­ро из цитоплазмы. Ламины разных видов взаимодействуют между сбой и образуют белковую сеть под внутренней мембраной ядерной оболочки. С помощью ламинов «В» ППП соединяется со спец интеграл белкомядерн оболочки. С ППП взаимодействуют и белки приферич голобул «внутр кольца» порового комплекса. К ламину «А» присоед теломерн участки хромосом.

Функции ламины: 1) поддерд форму ядра. (даже есл бое мембраны разруш, то ядро за счет ламины сохр свою форму и поровые комп-сы ост на своём месте.

2) служит компонентом кариоскелета

3) участв в сборке ядерн оболочки (формирование кариоллемы) при делен клетки.

4) в интерфазном ядре к ламине прикрепл хроматин. таким образом ламина обеспеч функцию фиксации хроматина в ядре (обеспеч упорядочн укладку хроматина, участвует в пространственной организации хроматина в интерфазном ядре). Ламин «А» взаимодейств с теломерными участками хромосом.

5) обеспеч структур организацию поровых комплексов.

импорт и экспор белков.

В ядро через ядерные поры поступают: синтезированные цитоплазматическими рибосомами белки-ферменты, которые участвуют в процессах репликации и репарации (восстановления повреждений в ДНК); белки-ферменты, участвующие в процессе транскрипции; белки-репрессоры, которые регулируют процесс транскрипции; белки-гистоны.(которые связаны с молекулой ДНК и образуют хроматин); белки, входящие в состав субъединиц рибосом: белки ядерного матрикса, образующие кариоскелет; нуклеотиды; ионы минеральных солей, в частности, ионы Са и Mg .

Из ядра в цитоплазму выходят и-РНК. т-РНК и субъединицы рибосом, которые представляют собой рибонуклеопротеидные частицы (р-РНК, связанные с белками).

5. Химический состав и структурная организация хроматина. уровни компактизации. хромосомы чел их строен и классификация.

В ядре клеток мелкие зернышки и глыбки материала, окрашиваются основными красителями.

Хроматин представляет собой дезоксирибонуклеопротеид (ДНП) и состоит из ДНК, соединённой с белка-ми-гистонами или негистоновыми белками. Гистоны и ДНК объединены в структуры, которые называются нуклеосомами. Хроматин соответствует хромосомам, которые в интерфазном ядре представлены длинными перекру­ченными нитями и неразличимы как индивидуальные структуры. Выраженность спирализации каждой из хромо­сом неодинакова по их длине. Реализацию генетической информации осуществляют деспирализованные участки хромосом.

классификация хроматина:

1) эухроматин (активный деспирализованный. на нем происход считывание инф (транскрипция). в ядре выявляется как более светлые участки ближе к центру ядра) Предполагается, что в нем сосредоточена та ДНК, которая в интерфазе генетически активна. Эухроматин соответствует сегментам хромосом, которые деспирализованы и от­крыты для транскрипции.

2) гетерохроматин (нерабочий спирализованный, конденсированный, более компактный В ядре выявляется в виде глыбок на периферии.) делится на: конститутивный (всегда неактивен, никогда не переходит в эухроматин) и Факультативный (при определён условиях или на определен стадиях иммунного цикла может переходить в эухроматин). располагается ближе к оболочке ядра, более компактный. Примером скопления факульт гетерохроматина является тельце Барра - инактивированная Х-хромосома у самок млекопитающих, которая в интерфазе плотно скручена и неактивна.

Таким образом, по морфологическим признакам ядра (по соотношению содержания эу- и гетерохромати­на) можно оценить активность процессов транскрипции, а, следовательно, синтетической функции клетки.

Хроматин и хромосомы представляют собой дезоксирибонуклеопротеиды (ДНП), но хроматин - это рас­крученное, а хромосомы - скрученное состояние. Хромосом в интерфазном ядре нет, хромосомы появляются при разрушении ядерной оболочки (во время деления).

Строение хромосом:

хромосомы - наиболее упакованное состояние хроматина.

В хромосомах различают первичную перетяжку (центромеру), разделяющую хромосому на два плеча. Пер­вичная перетяжка - наименее спирализованная часть хромосомы, к ней во время деления клетки присоединяются нити веретена деления. На некоторых хромосомах есть глубокие вторичные перетяжки, отделяющие небольшие участки хромосом, называемые спутниками. В области вторичных перетяжек находятся гены, кодирующие ин­формацию об р-РНК, поэтому вторичные перетяжки хромосом называются ядрышковыми организаторами.

В зависимости от места расположения центромеры различают три типа хромосом:

1) метацентрические (имеют плечи равной или почтиравной величины);

2) субметацентрические (имеют плечи неравной величины);

3) акроцентрические (имеют палочковидную форму с коротким, почти незаметным вторым плечом);

Концы плеч хромосом называются теломерами

Уровни компаюпизации хроматина:

1. Нуклеосомный - Два с половиной витка двойной спирали ДНК (в 146-200 пар нуклеотидов) наматываются снаружи на белковый кор, образуя нуклеосому. Ка­ждый гистон представлен двумя молекулами. ДНК наматывается на кор снаружи, образуя два с половиной витка. Участок ДНК между нуклеосомами называется линкером и имеет протяжбенность 50-60 пар нуклеотидов. Толщина нуклеосомной нити составляет 8-11 нм.

2. Нуклеомерный. Нуклеосомная структура закручивается, обра­зуя суперспираль. В её образовании принимает участие ещё один гистоновый белок HI, лежащий между нуклеосомами и связанный с линкером. К каждому линкеру присоединяется 1 молекула гистона HI. Молекулы HI в комплексе с линкерами взаимодействуют меж­ду собой и вызывают суперспирализацию нуклеосомной фибриллы.

В результате образуется хроматиновая фибрил­ла, толщина которой составляет 30 нм (ДНК компактизирована в 40 раз). Суперспирализация происходит двумя способами. 1) нуклеосомная фибрилла может образовывать спираль второго порядка, которая имеет форму соле­ноида; 2) 8-10 нуклеосом образуют крупную компактную структуру - нуклеомеру. Этот уровень не допускает синтеза РНК с нуклеомерной ДНК (транскрипция не происходит).

3. Хромомерный (петельная структура). Хроматиновая фибрилла образует петли, кото­рые сцепляются между собой с помощью осо­бых негистоновых белков, либо петельные цен­тры - хромомеры. Толщина 300 нм.

4. Хромонемный - образуется в результате сближения хромомеров по длине. Хромонема содержит одну гигантскую молекулу ДНК в комплексе с белками, т.е. фибриллу дезокси-рибонуклеопротеина - ДНП (400 нм).

5. Хроматидный - хромонема складывается несколько раз, образуя тело хроматиды (700 нм). После репликации ДНК хромосома со­держит 2 хроматиды.

6. Хромосомный (1400 нм). Состоит из двух хроматид. Хроматиды соединены центромерой. При делении клетки хроматиды расходятся, по­падая в разные дочерние клетки.

хромосомы человека

Кариоти́п - совокупность признаков (число, размеры, форма и т.д.) полного набора хромосом, присущий клеткам данного биологического вида (видовой кариотип ), данного организма (индивидуальный кариотип ) или линии (клона) клеток.

Для процедуры определения кариотипа могут быть использованы любые популяции делящихся клеток, для определения человеческого кариотипа используется либо одноядерные лейкоциты, извлечённые из пробы крови, деление которых провоцируется добавлением митогенов, либо культуры клеток, интенсивно делящихся в норме (фибробласты кожи, клетки костного мозга).

кариотип – диплойдный набор хромосом, свойтвенный соматическим клеткам организмов данного вида, являющийся видоспецифическим признаком и характеризующийся определённым числом и строением хромосом.

Хромосомный набор большинства клеток - диплоидный (2п) - это значит, что каждая хромосома имеет пару, т.е. гомологичную хромосому. Обычно диплоидный (2п) набор хромосом образуется в момент оплодотворения (одна из пары хромосом от отца, другая от матери). Некоторые клетки триплоидны (Зп), например клетки эндосперма.

Изменение числа хромосом в кариотипе человека может привести к различным заболеваниям. Наиболее частым хромосомным заболеванием у человека является синдром Дауна , обусловленный трисомией (к паре нормальных хромосом прибавляется еще одна такая же, лишняя) по 21-й хромосоме. Встречается этот синдром с частотой 1-2 на 1000.

Известны трисомии по 13-й хромосоме - Синдром Патау , а также по 18-й хромосоме - синдром Эдвардса , при которых жизнеспособность новорожденных резко снижена. Они гибнут в первые месяцы жизни из-за множественных пороков развития.
Достаточно часто у человека встречается изменение числа половых хромосом. Среди них известна моносомия Х (из пары хромосом присутствует только одна (Х0)) - это синдром Шерешевского-Тернера . Реже встречается трисомия Х и синдром Клайнфельтера (ХХУ, ХХХУ, ХУУ и т.д.)

6. Гиалоплазма. Органеллы, их классификация. Биологические мембраны.

гиалоплазма - часть цитоплазмы животных и растительных клеток, не содержащая структур, различимых в световом микроскопе.

Гиалоплазма (hyaloplasma; от греч. hyalinos - прозрачный) составляет примерно 53-55 % от общего объема цитоплазмы (cytoplasma), образуя гомогенную массу сложного состава. В гиалоплазме присутствуют белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, ферменты. При участии рибосом в гиалоплазме синте­зируются белки, происходят различные реакции промежуточно­го обмена. В гиалоплазме располагаются также органеллы, включения и клеточное ядро.

Основная роль гиалоплазмы – объединение всех клеточных структур в отношении их химического взаимодействия и обеспечения транспортных биохимических процессов.

Органеллы (organellae) являются обязательными микрострук­турами для всех клеток, выполняющими определенные жизнен­но важные функции. Различают мембранные и немембранные ор­ганеллы .

К мембранным органеллам , отграниченным от окру­жающей их гиалоплазмы мембранами, относятся эндоплазмати­ческая сеть, комплекс Гольджи, лизосомы, пероксисомы, митохондрии.

Эндоплазматическая сеть пред­ставляет собой единую непрерывную структуру, образованную системой цистерн, трубочек и уплощенных мешочков. На элек­тронных микрофотографиях различают зернистую (шерохова­тую, гранулярную) и незернистую (гладкую, агранулярную) эндо­плазматическую сеть. Внешняя сторона зернистой сети покрыта рибосомами, незернистая лишена рибосом. Зернистая эндо­плазматическая сеть синтезирует (на рибосомах) и транспорти­рует белки. Незернистая сеть синтезирует липиды и углеводы и участвует в их обмене (например, стероидные гормоны в корковом веществе надпочечников и клетках Лейдига (сустеноцитах) яичек; гликоген - в клетках печени). Одной из важнейших функций эндоплазматической сети является синтез мембран­ных белков и липидов для всех клеточных органелл.

комплекс Гольджи представляет собой совокупность ме­шочков, пузырьков, цистерн, трубочек, пластинок, ограничен­ных биологической мембраной. Элементы комплекса Гольджи соединены между собой узкими каналами. В структурах ком­плекса Гольджи происходят синтез и накопление полисахари­дов, белково-углеводных комплексов, которые выводятся из клеток. Так образуются секреторные гранулы. Комплекс Гольд­жи имеется во всех клетках человека, кроме эритроцитов и ро­говых чешуек эпидермиса. В большинстве клеток комплекс Гольджи расположен вокруг или вблизи ядра, в экзокринных клетках - над ядром, в апикальной части клетки. Внутренняя выпуклая поверхность структур комплекса Гольджи обращена в сторону эндоплазматической сети, а внешняя, вогнутая, - к цитоплазме.

Мембраны комплекса Гольджи образованы зернистой эндо­плазматической сетью и переносятся транспортными пузырька­ми. От внешней стороны комплекса Гольджи постоянно отпо­чковываются секреторные пузырьки, а мембраны его цистерн постоянно обновляются. Секреторные пузырьки поставляют мембранный материал для клеточной мембраны и гликокалик­са. Таким образом обеспечивается обновление плазматической мембраны.

Лизосомы представляют собой пузырьки диамет­ром 0,2-0,5 мкм, содержащие около 50 видов различных гидро­литических ферментов (протеазы, липазы, фосфолипазы, нук­леазы, гликозидазы, фосфатазы). Лизосомальные ферменты синтезируются на рибосомах зернистой эндоплазматической сети, откуда переносятся транспортными пузырьками в ком­плекс Гольджи. От пузырьков комплекса Гольджи отпочковыва­ются первичные лизосомы. В лизосомах поддерживается кислая среда, ее рН колеблется от 3,5 до 5,0. Мембраны лизосом устой­чивы к заключенным в них ферментам и предохраняют цито­плазму от их действия. Нарушение проницаемости лизосомаль­ной мембраны приводит к активации ферментов и тяжелым по­вреждениям клетки вплоть до ее гибели.

Во вторичных (зрелых) лизосомах (фаголизосомах) происхо­дит переваривание биополимеров до мономеров. Последние транспортируются через лизосомальную мембрану в гиалоплаз­му клетки. Непереваренные вещества остаются в лизосоме, в результате чего лизосома превращается в так называемое оста­точное тельце высокой электронной плотности.

Митохондрии (mitochondrii), являющиеся «энергетическими станциями клетки», участвуют в процессах клеточного дыхания и преобразования энергии в формы, доступные для использова­ния клеткой. Их основные функции - окисление органических веществ и синтез аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). Много крупных ми­тохондрий в кардиомиоцитах, мышечных волокнах диафрагмы. Они расположены группами между миофибриллами, окружены гранулами гликогена и элементами незернистой эндоплазмати­ческой сети. Митохондрии являются органеллами с двойными мембранами (толщина каждой около 7 нм). Между наружной и внутренней митохондриальными мембранами расположено меж­мембранное пространство шириной 10-20 нм.

К немембранным органоидам относятся клеточный центр эукариотических клеток и рибосомы, имеющиеся в цитоплазме как эу- , так и прокариотических клеток.

Рибосома - это округлая рибонуклеопротеиновая частица диа­метром 20-30 нм. Она состоит из малой и большой субъединиц, объединение которых происходит в присутствии матричной (ин­формационной) РНК (мРНК). Одна молекула мРНК обычно объ­единяет несколько рибосом наподобие нитки бус. Такую структуру называют полисомой. Полисомы свободно располагаются в основ­ном веществе цитоплазмы или прикреплены к мембранам шерохо­ватой цитоплазматической сети. В обоих случаях они служат местом активного синтеза белка.

70S - рибосомы обнаруживаются у прокариот и в хлоропластах и митохондриях эукариот. 8OS-рибосомы, несколько более крупные, находятся в цитоплазме эукариот. В процессе синтеза белка рибосомы дви­жутся вдоль мРНК. Процесс идет более эффективно, если вдоль мРНК движется не одна, а несколько рибосом. Такие цепи рибосом на мРНК называют полирибосомами, или полисомами.

МЕМБРАНЫ:

все мембраны образуют липопротеидные плёнки; имеют двойной слой липидов.

В составе мембран до 20% воды. липиды.

Мембраны состоят из липидов трех классов: фосфолипиды, гликолипиды и холестерол. Фосфолипиды и гликолипиды состоят из двух длинных гидрофобных углеводородных «хвостов», которые связаны с заряженной гидрофильной «головой». Холестерол придает мембране жесткость, занимая свободное пространство между гидрофобными хвостами липидов и не позволяя им изгибаться. Поэтому мембраны с малым содержанием холестерола более гибкие, а с большим - более жесткие и хрупкие.

Клеточные мембраны часто асимметричны, то есть слои отличаются по составу липидов, переход отдельной молекулы из одного слоя в другой (так называемый флип-флоп ) затруднен. Различается состав и ориентация мембранных белков.

Одна из важнейших функций биомембраны - барьерная. Например, мембрана пероксисом защищает цитоплазму от опасных для клетки пероксидов.

Еще одно важное свойство биомембраны - избирательная проницаемость.

Министерство образования Республики Беларусь

Учреждение образования

«Международный государственный экологический университет имени А.Д. Сахарова»

Факультет экологической медицины

Кафедра биохимии и биофизики

Молекулярная организация клеточного ядра

Выполнила:

студентка 4-го курса

Специальности МБД

92062-2 группы

Шилова Анастасия

Минск 2012
Содержание:

Введение…………………………………………………………3

1. Ядерная оболочка (кариолемма)…………………………….4
2. Строение ядерной оболочки…………………………...4
3. Структурная организация ядерных пор……………….5
4. Свойства ядерных пор………………………………….8
5. Нуклеопорины…………………………………………..8
6. Сборка и распад ядерной оболочки…………………...8
7. Химия ядерной оболочки……………………………...10
8. Ядерно - цитоплазматический транспорт…………………..11
9. Регуляция транспорта молекул через ядерную пору..12
10. Ядерный матрикс…………………………………………….17
11. Хроматин……………………………………………………..18
12. ДНК хроматина………………………………………...20
13. Белки хроматина……………………………………….21
14. Хромосомы……………………………………………..23
15. Ядрышко……………………………………………………...24
16. Количество ядрышек в клетке………………………...24
17. Физиология и химия ядрышка………………………...25
18. РНК ядрышек…………………………………………...26
19. ДНК ядрышек…………………………………………..26
20. Ультраструктура ядрышек…………………………….27
21. Судьба ядрышек при делении клеток………………...28
22. Кариоплазма………………………………………………….28
23. Роль ядра……………………………………………………...30

Заключение……………………………………………………...32

Список литературы………………………………………………..33

Введение:

Говоря о клеточном ядре, мы имеем в виду собственно ядра эукариотических клеток. Их ядра построены сложным образом и довольно резко отличаются от “ядерных” образований, нуклеоидов прокариотических организмов. У последних в состав нуклеоидов (ядроподобных структур) входит одиночная кольцевая молекула ДНК, практически лишенная белков. Иногда такую молекулу ДНК бактериальных клеток называют бактериальной хромосомой, или генофором (носителем генов). Бактериальная хромосома не отделена мембранами от основной цитоплазмы, однако собрана в компактную ядерную зону - нуклеоид, который можно видеть в световом микроскопе после специальных окрасок (рис.1) .

Рисунок 1. Строение ядра эукариотических и прокариотическтих клеток.

Сам термин “ядро” впервые был применен Броуном в 1833 г. д ля обозначения шаровидных постоянных структур в клетках растений. Позднее такую же структуру описали во всех клетках высших организмов.

Ядра имеют обычно шаровидную или яйцевидную форму; диаметр первых равен приблизительно 10 мкм, а длина вторых - 20 мкм. Ядро необходимо для жизни клетки, поскольку именно оно регулирует всю ее активность. Связано это с тем, что ядро несет в себе генетическую (наследственную) информацию, заключенную в ДНК.

1. Ядерная оболочка (кариолемма)

Кариолемма – ядерная оболочка, которая отделяет содержимое ядра от цитоплазмы (барьерная функция), в то же время обеспечивает регулируемый обмен веществ между ядром и цитоплазмой. Ядерная оболочка принимает участие в фиксации хроматина. Кариолемма состоит из двух билипидных мембран, внешней и внутренней ядерных мембран, разделенных перинуклеарным пространством шириной 20 – 100 нм. В кариолемме имеются поры диаметром 80 – 90 нм. В области пор внешняя и внутренняя ядерные мембраны переходят друг в друга, а перинуклеарное пространство оказывается замкнутым. Просвет поры закрывается специальным структурным образованием – комплексом поры, который состоит из фибриллярного и гранулярного компонентов. Гранулярный компонент представлен белковыми гранулами диаметром 25 нм, располагающимися по краю поры в 3 ряда. От каждой гранулы отходят фибриллы и соединяются в центральной грануле, располагающейся в центре поры. Комплекс поры играет роль диафрагмы, регулирующей ее проницаемость. Размеры поры стабильные для данного типа клетки, но число пор может меняться при ее дифференцировке. В ядрах сперматозоидов поры отсутствуют. На наружной поверхности ядерной мембраны могут локализоваться прикрепленные рибосомы. Кроме того, наружная ядерная мембрана может продолжаться в каналы ЭПС. В общем виде ядерная оболочка может быть представлена, как полый двухслойный мешок, отделяющий содержимое ядра от цитоплазмы. Из всех внутриклеточных мембранных компонентов таким типом расположения мембран обладают только ядро, митохондрии и пластиды. Однако ядерная оболочка имеет характерную особенность, отличающую ее от других мембранных структур клетки. Это наличие особых пор в оболочке ядра, которые образуются за счет многочисленных зон слияний двух ядерных мембран и представляет собой как бы округлые перфорации всей ядерной оболочки.

1. Строение ядерной оболочки

Внешняя мембрана ядерной оболочки, непосредственно контактирующая с цитоплазмой клетки, имеет ряд сруктурных особенностей, позволяющих отнести ее к собственно мембранной системе эндоплазматического ретикулума. Так, на внешней ядерной мембране обычно располагается большое количество рибосом. У большинства животных и растительных клеток внешняя мембрана ядерной оболочки не представляет собой идеально ровную поверхность - она можетобразовывать различной величины выпячивания или выросты в сторону цитоплазмы.

Внутренняя мембрана контактирует с хромосомным материалом ядра. Наиболее характерной и бросающейся в глаза структурой в ядерной оболочке является ядерная пора. Поры в оболочке образуются за счет слияния двух ядерных мембран в виде округлых сквозных отверстий или перфораций с диаметром 80-90 нм. Округлое сквозное отверстие в ядерной оболочке заполнено сложноорганизованными глобулярными и фибриллярными структурами. Совокупность мембранных перфораций и этих структур называют комплексом пор ядра. Тем самым подчеркивается, что ядерная пора не просто сквозная дыра в ядерной оболочке, через которую непосредственно вещества ядра и цитоплазмы могут сообщаться.

Сложный комплекс пор имеет октагональную симметрию. По границе округлого отверстия в ядерной оболочке располагаются три ряда гранул, по 8 штук в каждом: один ряд лежит со стороны ядра, другой - со стороны цитоплазмы, третий расположен в центральной части пор. Размер гранул около 25 нм. От этих гранул отходят фибриллярные отростки. Такие фибриллы, отходящие от периферических гранул, могут сходиться в центре и создавать как бы перегородку, диафрагму, поперек поры. В центре отверстия часто можно видеть так называемую центральную гранулу. Число ядерных пор зависит от метаболической активности клеток: чем выше синтетические процессы в клетках, тем больше пор на единицу поверхности клеточного ядра.

1. Структурная организация ядерных пор

Ядерные поры — это не просто перфорации, а сложно устроенные, многофункциональные регулируемые структуры, организованные приблизительно 30 белками — нуклеопоринами. Белковая составляющая ядерной поры обозначается термином «комплекс ядерной поры» (англ. nuclear pore complex , NPC ). Масса комплекса ядерной поры колеблется в пределах от ~44 МДа в клетках дрожжей до ~125 МДа у позвоночных. По данным электронной микроскопии, ядерные поры в поперечном сечении имеют форму «восьмиспицевого тележного колеса», то есть имеют ось симметрии восьмого порядка. Эти данные подтверждает тот факт, что молекулы нуклеопоринов присутствуют в составе ядерной поры в количестве, кратном восьми. Проницаемый для молекул канал располагается в центре структуры. Комплекс ядерной поры заякорен на ядерной оболочке с помощью трансмембранной части, от которой к просвету канала обращены структуры, получившие название спиц (англ., spokes), по аналогии со спицами тележного колеса. Эта коровая часть поры, построенная из восьми доменов, с цитоплазматической и ядерной сторон ограничена соответственно цитоплазматическим и ядерным кольцами (англ., rings; у низших эукариот они отсутствуют). К ядерному кольцу прикреплены белковые, направленные внутрь ядра, тяжи (ядерные филаменты, англ., filaments), к концам которых крепится терминальное кольцо (англ., terminal ring). Вся эта структура носит название ядерной корзины (англ., nuclear basket). К цитоплазматическому кольцу также прикреплены направленные в цитоплазму тяжи — цитоплазматические филаменты. В центре ядерной поры видна электрон-плотная частица, «втулка» или транспортер (англ., plug) (рис.2) .

Рис.2 Структура ядерной поры.

Многие индивидуальные компоненты ЯПК имеют субъединичное строение, что обеспечивает ее высокую пластичность в процессе молекулярного транспорта. Два периферических кольца диаметром около 120 нм - цитоплазматическое и внутриядерное ограничивают центральную часть ядерной поры, состоящую из двух зеркально симметричных отделов. Каждый из этих отделов включает 3 связанных друг с другом кольца: внутреннее, контактирующее с центральным транспортером; среднее, пронизывающее боковой участок ядерной мембраны, формирующей пору, и радиальное, расположенное в просвете между наружной и внутренней ядерными мембранами. Среднее и радиальное кольца обеспечивают прочное закрепление поры в ядерной оболочке, а внутреннее играет роль основного каркаса, вокруг и внутри которого собраны остальные компоненты поры. Центральный канал поры имеет вариабельный внутренний диаметр (меняющийся от 10 до 26 нм) и находится внутри транспортера, состоящего из 4 связанных между собой частей: 2-х симметричных тонкостенных цилиндров и 2-х одинаковых периферических гранул, которые привязаны 8-ю фибриллами к периферическим кольцам поры и закрывают оба входа в центральный канал. Транспортер занимает центральную часть внутреннего кольца поры.

Периферические отделы ЯПК являются несимметричными, что, вероятно, связано с различными механизмами ядерно-цитоплазматического транспорта молекул через пору на начальных этапах их импорта и экспорта. Со стороны цитоплазмы пора имеет 8 гранул, расположенных на цитоплазматическом кольце, как бусы на нитке, и содержащих короткие фибриллы, а со стороны ядра - 8 фибрилл, отходящих от внутриядерного кольца и формирующих структуру, похожую на баскетбольную корзину (названную баскет). В неактивной поре фибриллы баскета закрывают вход в пору, а в активной - формируют дополнительное кольцо диаметром около 50 нм.

Структурная организация ЯПК у всех высших организмов, включая человека, птиц, амфибий, насекомых и высших растений сходна и является высоко консервативной. Плотность расположения пор в ядерной оболочке (ЯО) варьирует в среднем от 13 до 30 пор на 1 мкм 2 поверхности ядра, достигая 5000 пор на одно ядро в ооцитах лягушки и ранних эмбрионах дрозофилы. Предполагается, что все ядерные поры являются универсальными и могут обеспечивать транспорт молекул как в ядро, так и в цитоплазму. Изменение числа поровых комплексов в ЯО высших эукариот может происходить при изменении функционального состояния клеток, вероятно, за счет их образования de novo . В то же время из-за тесной связи с ламиной, фибриллярной сетчатой структурой, расположенной с внутренней стороны ядерной оболочки.В отличие от высших организмов, низшие эукариоты (например, дрожжи) не имеют ламины, благодаря чему их ядерные поры могут свободно перемещаться вдоль ядерной оболочки, а их плотность в различных участках оболочки может существенно изменяться. Структура ядерных пор дрожжей до сих пор детально не изучена, хотя показано, что их диаметр (~100 нм) меньше, чем у пор высших организмов (~120 нм), а часть нуклеопоринов в них отсутствует. Вместо 50 нуклеопоринов пора дрожжей содержит только 30. Это согласуется с моделью ЯПК дрожжей, демонстрирующей ее более простое строение по сравнению с клетками высших эукариот. Так, например, в ЯПК дрожжей отсутствует радиальное кольцо в центральном компоненте поры. Однако периферические отделы в порах дрожжей также несимметричны, а центральный канал имеет те же размеры, что и аналогичный канал у высших эукариот. Наблюдаемая универсальность организации ЯПК предполагает, что именно такое строение необходимо для обеспечения возможности двунаправленного транспорта молекул через ЯПК.

1. Свойства ядерных пор

Количество ядерных пор на одно ядро может колебаться от 190 у дрожжей, 3000-5000 в клетках человека до 50 млн в зрелых ооцитах шпорцевой лягушки (Xenopus laevis ). Этот показатель может также варьировать в зависимости от типа клетки, гормонального статуса и стадии клеточного цикла. Например, в клетках позвоночных количество ядерных пор удваивается на протяжении S фазы, одновременно с удвоением хромосом. При разборке ядерной оболочки во время митоза ядерные поры позвоночных распадаются на субкомплексы с массами около миллиона дальтон. Показано, что разборка комплекса ядерной поры инициируется циклин B-зависимой киназой, фосфорилирующей нуклеопорины. После завершения клеточного деления ядерные поры собираются de novo . Ядерные поры интерфазного ядра перемещаются большими массивами, а не независимо друг от друга, причем эти перемещения происходят синхронно с перемещениями ядерной ламины . Это служит доказательством того, что ядерные поры механически связаны между собой и формируют единую систему (англ., NPC network).

1. Нуклеопорины

Нуклепорины, белки, из которых построены ядерные поры, делят на три подгруппы. К первой относят трансмембранные белки, заякоривающие комплекс в ядерной оболочке. Нуклепорины второй группы содержат характерный аминокислотный мотив — несколько раз повторенные FG, FXFG или GLFG — последовательности (так называемые FG-повторы, где F — фенилаланин, G — глицин, L — лейцин, X — любая аминокислота). Функция FG-повторов, по-видимому, заключается в связывании транспортных факторов, необходимых для осуществления ядерно-цитоплазматического транспорта. Белки третьей подгруппы не имеют ни мембранных доменов, ни FG- повторов, наиболее консервативны среди всех нуклеопоринов, их роль, по-видимому, заключается в обеспечении связывания FG-содержащих нуклепоринов с трансмембранными. Нуклеопорины также отличаются по своей мобильности в составе ядерной поры. Некоторые белки связаны с конкретной порой на протяжении всего клеточного цикла, в то время как другие полностью обновляются всего за несколько минут.

1. Сборка и распад ядерной оболочки

До настоящего времени вопрос о формировании и распаде ядерной оболочки (ЯО) и ЯПК в процессе митоза in vivo остается недостаточно изученным. Однако недавние эксперименты по инкубации цитоплазматического экстракта из ооцитов амфибий с хроматином спермы in vitro позволили при использовании высокоразрешающей сканирующей электронной микроскопии получить новые данные о регуляции этого процесса. Было показано, что за 1,5-2,5 часа инкубации в такой системе формируются функционально активные (способные к репликации и транскрипции) ядра со зрелыми ЯПК. На первом этапе гладкие и шероховатые пузырьки эндоплазматического ретикулума связываются с поверхностью деконденсирующегося хроматина и сплавляются вместе, формируя внутреннюю и наружную ядерные мембраны. Для осуществления этого процесса необходимы ионы Са 2 + и большое количество энергии, поставляемой ГТФ и АТФ. При этом было показано, что в формировании ядерной оболочки участвуют два типа пузырьков эндоплазматического ретикулума, различающихся по составу белков. После формирования вокруг хроматина замкнутой ЯО начинается сборка ЯПК. Сначала в различных местах ЯО появляются небольшие ямки, которые затем превращаются в 10-20 нм пустые поры. После этого размер пор увеличивается до 40 нм и далее начинается последовательное формирование сначала внутренних, а затем периферических компонентов поры. Установлено, что сборка составляющих пору компонентов происходит фрагментарно, сначала образуется одна составляющая компонент субъединица, затем вторая и т.д. При этом пора постепенно увеличивается в размере и за 4-6 минут превращается в зрелую пору диаметром 110-120 нм. До сих пор не ясно, какова последовательность сборки белков при формировании ЯПК de novo . Предполагается, что специфические белки, связываясь с мембранами ЯО, стимулируют их постепенное сближение и слияние, после чего к этому участку мембраны присоединяются интегральные белки POM121 и gp210, которые стабилизируют сформированное отверстие. Затем сюда доставляются другие нуклеопорины, необходимые для формирования центральных (комплекс р62) и периферических компонентов (Nup 358, Nup 214, Nup 153 и т.д.) поры, и, наконец, зрелая пора дополнительно закрепляется в ЯО с помощью белков ламины.

С использованием митотического экстракта в опытах in vitro , было показано, что распад ЯО происходит за счет отщепления от нее пузырьков эндоплазматического ретикулума (ЭР), а разборка ЯПК идет через промежуточные структуры, похожие на интермедиаты, которые наблюдаются при сборке ЯПК. При этом сначала разбираются периферические, а затем центральные компоненты ЯПК. Результаты экспериментов по исследованию сборки и распада ядерных пор in vitro были подтверждены в опытах in vivo при исследовании деления ядер в ранних эмбрионах дрозофилы. Было продемонстрировано, что разборка пор происходит в профазе митоза, сначала разбираются центральные, затем периферические компоненты пор. Сборка новых пор начинается в телофазе после формирования ЯО и проходит через те же промежуточные формы, которые наблюдались при формировании пор в опытах in vitro. Интересно, что наиболее формирование пор в экспериментах in vivo инициируется преимущественно в участках слияния мембран пузырьков эндоплазматического ретикулума с наружной ядерной мембраной.

Помимо поровых комплексов в ЯО, подобные структуры были обнаружены и в цитоплазме, в составе мембран ЭР. Белковый состав этих пороподобных комплексов сходен с белками ЯПК. Однако, в отличие от ЯПК, их формирование в системе in vitro происходит в отсутствие хроматина. Эти специфические мембраны ЭР были названы дырчатыми или окончатыми мембранами (AL-annulate lamellae). Интересно, что дырчатые мембраны с порами очень похожими на ЯПК, отсутствуют в соматических клетках, но выявляются в больших количествах в быстро делящихся клетках, таких, как яйцеклетки, эмбриональные и опухолевые клетки. Функциональная роль этих структур пока слабо изучена. Предполагается, что эти структуры представляют собой депо белков ядерных пор и могут участвовать в сборке ЯПК в случае быстрых митозов, однако механизмы регуляции этого процесса, а также особенности использования этих структур при формировании ЯО и ЯПК in vivo почти не изучены.

1. Химия ядерной оболочки

В составе ядерных оболочек обнаруживаются небольшие количества ДНК (0-8%), РНК (3-9%), но основными химическими компонентами являются липиды (13-35%) и белки (50-75%), что для всех клеточных мембран. Состав липидов сходен с таковым в мембранах микросом или мембранах

эндоплазматической сети. Ядерные оболочки характеризуются относительно низким содержанием холестерина и высоким - фосфолипидов, обогащенных насыщенными жирными кислотами. Белковый состав мембранных фракций очень сложен. Среди белков обнаружен ряд ферментов, общих с ЭР (например, глюкозо-6-фосфатаза, Mg-зависимая АТФаза, глютамат-дегидрогеназа и др.) не обнаружена РНК-полимераза. Тут выявлены активности многих окислительных ферментов (цитохромоксидазы, НАДН- цитохром-с-редуктазы) и различных цитохромов. Среди белковых фракций ядерных мембран встречаются основные белки типа гистонов, что объясняется связью участков хроматина с ядерной оболочкой.

1. Ядерно-цитоплазматический транспорт

Ядерно-цитоплазматическим транспортом называется материальный обмен между Клеточное ядром и цитоплазмой клетки . Ядерно-цитоплазматический транспорт можно разделить на две категории: активный транспорт, требующий затрат энергии, а также специальных белков-рецепторов, и пассивный транспорт, протекающий путем простой диффузии молекул через канал ядерной поры.

Молекулы небольших размеров (ионы, метаболиты , мононуклеотиды и т. д.) способны пассивно диффундировать в ядро. Проводимость ядерных пор для молекул разных размеров различна. Белки массой менее 15 кДа быстро проникают в ядро, в то время как для белка массой более 30 кДа на это требуется определенное время. Белковые молекулы массой более 60-70 кДа, по-видимому, вообще не могут пассивно проходить через ядерные поры. Впрочем, пропускная способность ядерных пор для пассивной диффузии может изменяться в зависимости от типа клетки и стадии клеточного цикла.

Путём активного транспорта через ядерные поры могут проходить гораздо более крупные молекулы и целые надмолекулярные комплексы. Так, рибосомные субчастицы размерами до нескольких мегадальтон транспортируются из ядра в цитоплазму через ядерные поры, и нет никаких оснований предполагать, что процесс транспорта сопровождается частичной разборкой этих субчастиц. Системы активного транспорта обеспечивают весь макромолекулярный обмен между ядром и цитоплазмой. Молекулы РНК, синтезируемые в ядре, поступают через поры в цитоплазму, а в ядро попадают белки, участвующие в ядерном метаболизме. Причем одни белки должны поступать в ядро конститутивно (например, гистоны), а другие в ответ на определенные стимулы (например, транскрипционные факторы). У ядерных белков идентифицированы специальные последовательности, отвечающие за их локализацию. Самая распространенная из них, так называемый «классический» сигнал ядерной локализации — NLS (от англ., Nuclear Localization Signal), представляет собой один или два участка положительно заряженных аминокислот, аргинина и лизина . Транслокация белков в ядро, в отличие от транслокации в митохондрии и эндоплазматический ретикулум, не сопровождается отщеплением этой сигнальной последовательности и разворачиванием полипептидной цепи. NLS-содержащие белки, как и все другие субстраты систем ядерного транспорта, переносятся в ядро в комплексе со специальными белками — транспортинами или кариоферинами (англ., transportins, karyopherins). Каждый транспортин или комплекс транспортинов для осуществления своей функции должен обладать тремя активностями: во-первых, он должен узнавать и связывать транспортируемый субстрат, во-вторых, заякориваться на ядерной поре, и в-третьих, связывать небольшой белок — GTPазу Ran, относящуюся к семейству Ras-подобных ГТФаз и служащую для сопряжения транспорта с гидролизом ГТФ, что придает процессу необратимость (снабжает его энергией). Собственно акт гидролиза ГТФ осуществляется непосредственно этим белком. Фактор обмена нуклеотидов (англ., GTPase Еxchange Factor, GEF) для Ran, хроматин-связывающй белок RCC1, локализован строго в ядре, а активаторы ГТФазной активности (англ., GTPase Activation Protein, GAP) RanGAP1 и некоторые другие белки — строго в цитоплазме. Эта асимметричная локализация приводит к формированию градиента: в ядре находится преимущественно ГТФ-связанная форма Ran, в цитоплазме, наоборот, ГДФ-связанная. Ran используется для снабжения энергией как процессов импорта, так и процессов экспорта различных субстратов, а вся схема носит название Ran-цикла (англ., Ran-cycle). Ran-цикл снабжает энергией и экспорт, и импорт, используя общий принципиальный механизм, ключевыми стадиями которого являются гидролиз ГТФ в цитоплазме и обмен ГДФ на ГТФ в ядре.

1. Регуляция транспорта молекул через ядерную пору

Поскольку активный транспорт молекул между ядром и цитоплазмой, осуществляемый ЯПК, является жизненно важным для обеспечения различных внутриклеточных процессов, то он контролируется многими факторами. Они включают в себя 3 взаимодействующих между собой системы: 1) комплекс биохимических регуляторов, находящихся в ядре или в цитоплазме и связывающихся с сигнальными последовательностями транспортируемой молекулы и белками ядерной поры; 2) комплекс нуклеопоринов, формирующих ЯПК и способных взаимодействовать друг с другом и биохимическими регуляторами, и 3) структурный комплекс поры, состоящий из набора индивидуальных компонентов, специфически меняющих пространственную организацию в процессе транспорта молекул и обеспечивающих, таким образом, их более эффективный перенос в нужном направлении. Рассмотрим коротко, как регулируется транспорт этими тремя системами.

Первая система . Биохимические регуляторы насчитывают 5 основных типов белков, участвующих, как в импорте, так и в экспорте молекул: 1) транспортины (импортин a, импортин b и ряд других факторов); 2) Ran-белок (гуанозинтрифосфатаза), 3) ГТФ (гуанозинтрифосфат), 4) белок р10, а также 5) набор дополнительных белков, обеспечивающих активацию, ингибирование или изменение структурной конформации перечисленных выше белков, а также их транспорт между ядром и цитоплазмой. Функциональная роль каждого из перечисленных регуляторов была установлена в исследованиях, проведенных либо в системе in vitro (с использованием экстрактов из ооцитов амфибий), либо in vivo (преимущественно в экспериментах с дрожжевыми клетками). Транспортины играют роль рецепторных белков, которые через белки-посредники (адапторные белки) или напрямую связываются с сигнальными участками транспортируемой молекулы. Ran -это белок, который способен утилизировать энергию ГТФ. Он может иметь два состояния: связан либо с ГТФ (Ran-ГТФ) либо с ГДФ (Ran-ГДФ). Ran плохо гидролизует ГТФ, и для изменения его состояния необходимы дополнительные белки, находящиеся в ядре (RCCI) и в цитоплазме (RanGAP1, RanBP1, и RanBP2). Обе формы Ran присутствуют и в ядре и в цитоплазме, однако концентрация Ran-ГТФ выше в ядре, в то время как Ran-ГДФ обнаруживается преимущественно в цитоплазме.

Предполагается, что белок р10 регулирует доступ транспортируемых комплексов в центральный канал поры со стороны цитоплазмы, возможно за счет его взаимодействия с нуклеопоринами, формирующими периферические компоненты поры (запирающая гранула транспортера, внутренние филаменты и другие). Однако основная функция этого белка заключается в том, что он способен связываться с Ran белком (в различных его формах) и транспортировать его в ядро или в цитоплазму.

Процесс импорта молекул в ядро изучен в настоящее время более подробно, чем их экспорт. Первым требованием к транспортируемой молекуле является наличие в ее структуре сигнальной последовательности. Предполагается, что процесс импорта белка в ядро включает в себя несколько последовательных этапов: сначала импортин b связывается с импортином a, который затем напрямую или через адапторные белки узнает сигнальную последовательность в транспортируемой молекуле и связывается с ней. Этот тройной комплекс, благодаря взаимодействию импортина b с одним из периферических нуклеопоринов, закрепляется на периферическом компоненте поры, возможно, на цитоплазматической фибрилле. Параллельно с этим Ran -белок связывается в цитоплазме с ГТФ, после чего этот комплекс также закрепляется на цитоплазматической фибрилле, благодаря взаимодействию Ran -белка с нуклеопорином, недалеко от первого комплекса. Все эти процессы происходят без потребления энергии. Затем два комплекса взаимодействуют между собой и белком р10, обеспечивающим подготовку периферического отдела центрального канала для транспорта (предполагается, что р10 может открывать вход в центральный канал поры со стороны цитоплазмы). При этом происходит гидролиз ГТФ, и весь сформированный комплекс перемещается с цитоплазматической фибриллы в центральную часть поры и далее транспортируется внутрь ядра. Цитоплазматический вход в центральный канал поры после этого закрывается, а переместившийся в ядро комплекс отделяется от перенесенной молекулы и распадается на димер, состоящий из импортинов a и b, и Ran -ГДФ. Последний комплекс с помощью специфического фактора опять переводится в Ran -ГТФ, который затем разъединяет импортин a и импортин b. В последнее время появились данные о том, что многие молекулы могут импортироваться в ядро без участия Ran и, соответственно, без потребления энергии. При этом соответствующие транспортины и адапторные белки связываются в цитоплазме с импортируемым субстратом, и этот комплекс проходит через ядерную пору в ядро. В ядре транспортные факторы этого комплекса взаимодействуют с Ran-ГТФ, что приводит к высвобождению импортированного субстрата за счет превращения Ran-ГТФ в Ran-ГДФ. Затем транспортные факторы опять связываются с Ran-ГТФ и этот комплекс возвращается в цитоплазму.

Предполагается, что многие из перечисленных выше биохимических факторов могут принимать участие в регуляции не только импорта, но и экспорта белков, а также РНК из ядра в цитоплазму. Однако процесс экспорта мРНК из ядра является более сложным по сравнению с импортом или экспортом белков, поскольку находится под контролем многих дополнительных факторов, включающих различные РНК-связывающие белки. Так, например, показано, что при экспорте мРНК из ядра она направляется в центральный канал поры 5’-концом, и важную роль в этом процессе, вероятно, играют кэп-связывающие белки, находящиеся на 5’-конце мРНК. Показано также, что для каждого класса РНК (мРНК, тРНК, рРНК, сплайсосомных РНК) существуют свои специфические белки-переносчики, одни из которых отсоединяются от РНК в процессе ее транспорта через пору и остаются в ядре, в то время как другие сопровождают молекулу РНК в цитоплазму (рис.3) .

Рис.3. Схема импорта белков в ядро.
1. Образование комплекса груз-рецептор (импортин). 2. Заякоривание комплекса на белках ядерной поры и собственно транслокация. 3. Диссоциация комплекса груз-импортин под воздействием Ran-ГТФ, высвобождение груза, образование комплекса Ran-ГТФ-импортин. 4. Реэкспорт образовавшегося комплекса в цитоплазму. 5. Гидролиз ГТФ и диссоциация комплекса.

При экспорте молекул Ran-ГТФ образует комплекс с транспортинами, соответствующими адапторными белками и экспортируемым субстратом. Весь этот сложный комплекс проходит через пору в цитоплазму. Здесь цитоплазматические факторы RanGAP1, RanBP1, и RanBP2 стимулируют гидролиз ГТФ, что вызывает распад транспортированного комплекса с высвобождением Ran-ГДФ. То есть выделяющаяся при этом энергия используется для освобождения транспортируемых молекул от их переносчиков. Белок р10, который за счет небольших размеров (м.в. 10кДа) может свободно диффундировать между ядром и цитоплазмой, связывается в цитоплазме с Ran-ГДФ и транспортирует его в ядро. В ядре находится связанный с хроматином фактор RCCI, который вызывает высвобождение ГДФ и переход Ran в ГТФ-связанную форму. Процесс циркуляции Ran между ядром и цитоплазмой носит название ГТФ-азного цикла Ran. Таким образом, можно предположить, что градиент концентрации Ran, постоянно поддерживаемый между ядром и цитоплазмой, представляет механизм, определяющий направленность транспорта (рис.4) .

Рис. 4. Схема экспорта белков из ядра.
1. Образование комплекса груз-экспортин-Ran-ГТФ. 2. Заякоривание комплекса на белках ядерной поры и собственно транслокация. 3. Гидролиз ГТФ, диссоциация комплекса и высвобождение груза. 4. Реимпорт высвободившегося экспортина .

Вторая система . Из 50 предполагаемых нуклеопоринов (Nup), входящих в состав ядерной поры высших эукариот, в настоящее время описано около 40 белков, 25 из которых уже секвенированы. Практически все белки ядерной поры охарактеризованы дрожжей (30 белков), а экспериментальные данные, полученные на высших организмах, являются малочисленными. Распределение многих нуклеопоринов на различных структурных компонентах поры было изучено иммуногистохимически с использованием антител к этим белкам. Установлено, что белки ЯПК можно условно разделить на 3 группы: первая содержит в своем составе белки со специфическими повторяющимися последовательностями (типа FXFG и др.), которые узнаются биохимическими факторами; вторая содержит белки, не имеющие таких последовательностей, а третья включает так называемые интегральные белки, локализующиеся либо в мембране ядерной оболочки, формирующей пору, либо в участке поры, находящемся в просвете между ядерными мембранами. Сравнительный анализ нуклеопоринов у высших и низших эукариот показал наличие 30-50% гомологии для 4 пар белков: Nup62/Nsp1p; Nup107/Nup84; Nup155/Nup170; Nup98/Nup116 (первыми в парах указаны белки высших, вторыми - белки низших эукариот; названия белков приводятся согласно общепринятой в литературе классификации). В последнее время было установлено, что нуклеопорины могут образовывать сложные комплексы, состоящие из 5-7 белков, что, вероятно, отражает их участие в формировании индивидуальных компонентов поры. Некоторые из нуклеопоринов, такие, как Nup188, Nup170, Nup157, Nic 96, POM152 составляют до 25% массы ядерных пор и присутствуют в 10-20 копиях на одну пору. Получены доказательства того, что нуклеопорины принимают непосредственное участие в регуляции транспорта молекул через ЯПК. Благодаря их взаимному контакту, а также взаимодействию с биохимическими факторами, несущими транспортируемую молекулу, они могут обеспечивать ее последовательную передачу, подобно эстафетной палочке, из одного участка ядерной поры в другой. Некоторые из нуклеопоринов могут, очевидно, напрямую связываться с транспортируемой молекулой. Так, например, Nup153 и Nup98, входящие в состав баскет-фибрилл, содержат РНК-связывающие домены, а Nup358 и CAN/Nup214, располагающиеся на цитоплазматических фибриллах поры, узнают сигнальные последовательности некоторых белков. Транспорт молекул через центральные компоненты поры находится под контролем белка Nup62, который является самым представительным и распределен вдоль всего центрального канала.

Третья система . Использование высокоразрешающего сканирующего электронного микроскопа позволило впервые зафиксировать конформационные изменения индивидуальных компонентов ЯПК в процессе молекулярного транспорта. Было показано, что экспорт гигантской мРНК, синтезируемой генами колец Бальбиани у хирономуса, сопровождается циклической реорганизацией баскета и транспортера, функционирующих, как система открывающихся и закрывающихся диафрагм. Согласно наблюдениям, сделанным нами в сканирующем электронном микроскопе, в неактивной поре оба входа в центральный канал поры закрыты периферическими гранулами транспортера. Кроме того, вход в пору со стороны ядра дополнительно закрыт фибриллами баскета. На первом этапе экспорта молекула РНК, упакованная в процессе транскрипции с белками в 50 нм РНП частицу, перемещается внутри ядра к поре и прикрепляется к верхушке баскета. Предполагается, что Nup153 и Nup98, входящие в состав баскета, принимают активное участие в этом событии. Баскет-фибриллы формируют увеличивающееся в размере кольцо, которое постепенно захватывает частицу, и она погружается внутрь баскета. Поскольку максимальный диаметр центрального канала ЯПК составляет всего 26 нм, РНП частица внутри баскета декомпактизуется в 26 нм фибриллу. Было также обнаружено, что РНП частица вращается внутри баскета, что, вероятно, связано с необходимостью ее транспортировки в пору 5’-концом. Таким образом, баскет структура выполняет как бы роль “таможни”, проверяя и подготавливая молекулу РНП к транспорту через пору.

На следующем этапе в периферической грануле транспортера со стороны ядра открывается отверстие и РНП фибрилла начинает перемещаться внутрь поры. Внутренний диаметр центральных цилиндров транспортера, имевший до этого размер 10 нм, расширяется до 26 нм, и фибрилла транспортируется через них дальше, в сторону цитоплазмы. Периферическая гранула транспортера со стороны цитоплазмы также формирует отверстие диаметром 26 нм, и РНП фибрилла постепенно полностью выходит в цитоплазму, где начинается процесс трансляции. После окончания транспорта все компоненты ЯПК быстро возвращаются в исходное состояние. Было установлено, что в процессе транспорта периферические гранулы транспортера могут перемещаться в вертикальном направлении на 5 нм, а сама пора - уплощаться или вытягиваться, способствуя, таким образом, более эффективному перемещению транспортируемой молекулы. Все эти данные свидетельствуют о том, что ЯПК является очень пластичной и динамичной структурой, непосредственно участвующей в регуляции транспорта. Вместе с тем следует отметить, что в последние годы появились данные о том, что пора может активно транспортировать до 300 и более небольших молекул в секунду. Это предполагает наличие каких-то дополнительных и пока неизвестных нам механизмов обеспечивающих такую высокую скорость перемещения молекул через пору. Поскольку пора с одной стороны тесно связана с ламиной и, следовательно, с ядерным матриксом, а с другой - через ядерную оболочку с цитоскелетом, процесс транспорта через ЯПК может также регулироваться на уровне этих внутриклеточных структур.

1. Ядерный матрикс

Этот комплекс не представляет собой какую-то чистую фракцию, сюда входят компоненты и ядерной оболочки, и ядрышка, и кариоплазмы. С ядерным матриксом оказались связаны как гетерогенная РНК, так и часть ДНК. Эти наблюдения дали основание считать, что матрикс ядра играет важную роль не только в поддержании общей структуры интерфазного ядра, но и может участвовать в регуляции синтеза нуклеиновых кислот. Ядерным матриксом некоторые исследователи называют нерастворимый внутриядерный каркас. Считается, что матрикс построен преимущественно из не гистоновых белков, формирующих сложную разветвленную сеть, сообщающуюся с ядерной ламиной . Возможно, ядерный матрикс принимает участие в формировании функциональных доменов хроматина. В геноме клетки имеются специальные незначащие А-Т-богатые участки прикрепления к ядерному матриксу (англ. S/MAR — M atrix/ S caffold A ttachment R egions), служащие, как предполагается, для заякоривания петель хроматина на белках ядерного матрикса. Впрочем, не все исследователи признают существование ядерного матрикса.

1. Хроматин

Хроматин представляет собой вещество, хорошо воспринимающее краситель (хромос), откуда и произошло его название. Хроматин состоит из хроматиновых фибрилл толщиной 20 – 25 н м, которые могут располагаться в ядре рыхло или компактно. На этом основании можно выделить эухроматин – рыхлый (или деконденсированный) хроматин, слабо окрашиваемый основными красителями, и гетерохроматин – компактный (или конденсированный) хроматин, хорошо окрашиваемый основными красителями. При подготовке клетки к делению в ядре происходит спирализация хроматиновых фибрилл и превращение хроматина в хромосомы. После деления в ядрах дочерних клеток происходит деспирализация хроматиновых фибрилл, и хромосомы снова преобразуются в хроматин. Таким образом, хроматин и хромосомы являются различными состояниями одного и того же вещества. Соотношение эухроматина и гетерохроматина является показателем синтетической активности клетки. На хроматиновых фибриллах в S-периоде интерфазы осуществляется редупликация ДНК. Эти процессы могут протекать также и в гетерохроматине, но значительно дольше. При наблюдении некоторых живых клеток, особенно растительных или же клеток после фиксации и окраски, внутри ядра выявляются зоны плотного вещества. В состав хроматина входит ДНК в комплексе с белком. В интерфазных клетках хроматин может равномерно заполнять объем ядра или же располагаться отдельными сгустками (хромоцентры). Часто он особенно четко выявляется на периферии ядра (пристеночный, примембранный хроматин) или образует внутри ядра переплетения довольно толстых (около 0.3 мкм) и длинных тяжей, образующих подобие внутриядерной цепи. Хроматин интерфазных ядер представляет собой несущие ДНК тельца (хромосомы), которые теряют в это время свою компактную форму, разрыхляются, деконденсируются. Степень такой деконденсации хромосом может быть различной в ядрах разных клеток. Когда хромосома или ее участокполностью деконденсирован, тогда эти зоны называют диффузным хроматином.

При неполном разрыхлении хромосом в интерфазном ядре видны участки

конденсированного хроматина (иногда называемого гетерохроматин). Показано, что степень деконденсации хромосомного материала в интерфазе может отражать функциональную нагрузку этой структуры. Чем более диффузен хроматин интерфазного ядра, тем выше в нем синтетические процессы. Падение синтеза РНК в клетках обычно сопровождается увеличением зон конденсированного хроматина. Максимально конденсирован хроматин во время митотического деления клеток, когда он обнаруживается в виде плотных телец - хромосом. В этот период хромосомы не несут никаких синтетических нагрузок, в них не происходит включение предшественников ДНК и РНК. Исходя из этого можно считать, что хромосомы клеток могут находиться в двух структурно-функциональных состояниях:

В рабочем, частично или полностью деконденсированном, когда с их

участием в интерфазном ядре происходят процессы транскрипции и

редупликации;

В неактивном - в состоянии метаболического покоя при максимальной их

конденсированности, когда они выполняют функцию распределения и

перенося генетического материала в дочерние клетки.

В химическом отношении препараты хроматина представляют собой сложные комплексы дезоксирибонуклеопротеидов, в состав которых входит ДНК и специальные хромосомные белки - гистоны. В составе хроматина обнаружено также РНК. В количественном отношении ДНК, белок и РНК находятся как 1:1,3:0,2. О значении РНК в составе хроматина еще нет достаточно однозначных данных. Возможно, что эта РНК представляет собой сопутствующую препарату функцию синтезирующейся РНК и поэтому частично связанной с ДНК или это особый вид РНК, характерный для структуры хроматина. Огромная длина молекул ДНК эукариот предопределила появление специальных механизмов хранения, репликации и реализации генетического материала. Хроматином называют молекулы хромосомной ДНК в комплексе со специфическими белками , необходимыми для осуществления этих процессов. Основную массу составляют «белки хранения», так называемые гистоны . Из этих белков построены нуклеосомы - структуры, на которые намотаны нити молекул ДНК. Нуклеосомы располагаются довольно регулярно, так что образующаяся структура напоминает бусы. Нуклеосома состоит из белков четырех типов: H2A, H2B, H3 и H4. В одну нуклеосому входят по два белка каждого типа — всего восемь белков. Гистон H1, более крупный чем другие гистоны, связывается с ДНК в месте ее входа на нуклеосому. Нуклеосома вместе с H1 называется хроматосомой. Нить ДНК с нуклеосомами образует нерегулярную соленоид -подобную структуру толщиной около 30 нанометров , так называемую 30 нм фибриллу. Дальнейшая упаковка этой фибриллы может иметь различную плотность. Если хроматин упакован плотно, его называют конденсированным или гетерохроматином, он хорошо видим под микроскопом. ДНК, находящаяся в гетерохроматине, не транскрибируется , обычно это состояние характерно для незначимых или молчащих участков. В интерфазе гетерохроматин обычно располагается по периферии ядра (пристеночный гетерохроматин). Полная конденсация хромосом происходит перед делением клетки. Если хроматин упакован неплотно, его называют эу- или интерхроматином. Этот вид хроматина гораздо менее плотный при наблюдении под микроскопом и обычно характеризуется наличием транскрипционной активности. Плотность упаковки хроматина во многом определяется модификациями гистонов — ацетилированием и фосфорилированием .

Считается, что в ядре существуют так называемые функциональные домены хроматина(ДНК одного домена содержит приблизительно 30 тысяч пар оснований), то есть каждый участок хромосомы имеет собственную «территорию». К сожалению, вопрос пространственного распределения хроматина в ядре изучен пока недостаточно. Известно, что теломерные (концевые) и центромерные (отвечающие за связывание сестринских хроматид в митозе ) участки хромосом закреплены на белках ядерной ламины.

1. ДНК хроматина

В препарате хроматина на долю ДНК приходится обычно 30-40%. Эта ДНК представляет собой двухцепочечную спиральную молекулу. ДНК хроматина обладает молекулярной массой 7-9*106. Такую сравнительно малую массу ДНК из препаратов можно объяснить механическими повреждениями ДНК в процессе выделения хроматина. Общее количество ДНК, входящее в ядерные структуры клеток, в геном организмов, колеблется от вида к виду. Сравнивая количество ДНК на клетку у эукариотических организмов, трудно уловить какие-либо корреляции между степенью сложности организма и количеством ДНК на ядро. Примерно одинаковое количество ДНК имеют различные организмы, как лен, морской еж, окунь (1,4-1,9 пг) или рыба голец и бык (6,4 и 7 пг). У некоторых амфибий в ядрах количество ДНК больше, чем в ядрах человека, в 10-30 раз, хотя генетическая конституция человека несравненно сложнее, чем у лягушек. Следовательно, можно предполагать, что “избыточное” количество ДНК у более низко организованных организмов либо не связано с выполнением генетической роли, либо число генов повторяется то или иное число раз. Сателлитная ДНК, или фракция ДНК с часто повторяющимися последовательностями, может участвовать в узнавании гомологичных районов хромосом при мейозе. По другим предположениям, эти участки играют роль разделителей (спейсеров) между различными функциональными единицами хромосомной ДНК. Как оказалось, фракция умеренно повторяющихся (от 102 до 105 раз) последовательностей принадлежит к пестрому классу участков ДНК, играющих важную роль в обменных процессах. В эту фракцию входят гены рибосомных ДНК, многократно повторенные участки для синтеза всех тРНК. Более того, некоторые структурные гены, ответственные за синтез определенных белков, также могут быть многократно повторены, представлены многими копиями (гены для белков хроматина - гистонов).

Итак, ДНК эукариотических клеток гетерогенна по составу, содержит несколько классов последовательностей нуклеотидов:

Часто повторяющиеся последовательности (>106 раз), входящие во фракцию сателитной ДНК и не транскрибирующиеся;

Фракция умеренно повторяющихся последовательностей (102-105), представляющих блоки истинных генов, а также короткие последовательности, разбросанные по всему геному;

Фракция уникальных последовательностей, несущая информацию для

большинства белков клетки.

ДНК прокариотического организма представляет собой одну гигантскую

циклическую молекулу. ДНК эукариотических хромосом представляет собой линейные молекулы, состоящие из тандемно (друг за другом) расположенных репликонов разного размера. Средний размер репликона около 30 мкм. Тем самым в составе генома человека должно встречаться более 50 000 репликонов, участков ДНК, которые синтезируются как независимые единицы. Эти репликоны имеют начальную и терминальную точки синтеза ДНК. Представим себе, что у эукариотических клеток каждая из хромосомных ДНК, как и у бактерий, является одним репликоном. В этом случае при скорости синтеза 0,5 мкм в минуту (для человека) редупликация первой хромосомы с длиной ДНК около 7 см должна занять 140 000 минут, или около трех месяцев. На самом же деле благодаря полирепликонному строению молекул ДНК весь процесс занимает 7-12 ч.

1. Белки хроматина

К ним относятся гистоны и негистоновые белки.

Гистоны - сильноосновные белки. Их щелочность связана с их обогащенностью основными аминокислотами (главным образом лизином и аргинином). Эти белки не содержат триптофана. Препарат суммарных гистонов можно разделить на 5 фракций:

Н1 (от английского histone) - богатый лизином гистон, мол. Масса 2100;

Н2а - умеренно богатый лизином гистон, масса 13 700;

Н2б - умеренно богатый лизином гистон, масса 14 500;

Н4 - богатый аргинином гистон, масса 11 300;

Н3 - богатый аргинином гистон, масса 15 300.

В препаратах хроматина эти фракции гистонов обнаруживаются в приблизительно равных количествах, кроме Н1, которого примерно в 2 раза меньше любой из других фракций. Для молекул гистонов характерно неравномерное распределение основных аминокислот в цепи: обогащенные положительно заряженными аминогруппами наблюдается на концах белковых цепей. Эти участки гистонов связываются с фосфатными группировками на ДНК, в то время как сравнительно менее заряженные центральные участки молекул обеспечивают их взаимодействие между собой. Таким образом, взаимодействие между гистонами и ДНК, приводящее к образованию дезоксирибонуклеопротеинового комплекса, носит ионный характер. Гистоны синтезируются на полисомах в цитоплазме, этот синтез начинается несколько раньше редупликации ДНК. Синтезированные гистоны мигрируют из цитоплазмы в ядро, где и связываются с участками ДНК. Функциональная роль гистонов не вполне ясна. Одно время считалось, что гистоны являются специфическими регуляторами активности ДНК хроматина, но одинаковость строения основной массы гистонов говорит о малой вероятности этого. Более очевидна структурная роль гистонов, которая обеспечивает не только специфическую укладку хромосомной ДНК, но и играет роль в регуляции

транскрипции. Негистоновые белки - наиболее плохо охарактеризованная фракция хроматина. Кроме ферментов, непосредственно связанных с хроматином (ферменты, ответственные за репарацию, редубликацию, транскрипцию и модификации ДНК, ферменты модификации гистонов и других белков), в эту фракцию входит множество других белков. Весьма вероятно, что часть негистоновых белков представляет собой специфические белки - регуляторы, узнающие определенные нуклеотидные последовательности в ДНК.

РНК хроматина составляет от 0,2 до 0,5% от содержания ДНК. Эта РНК представляет собой все известные клеточные типы РНК, находящиеся в процессе синтеза или созревания в связи с ДНК хроматина. В составе хроматина могут быть обнаружены липиды до 1 % от весового содержания ДНК, их роль в структуре и функционировании хромосом остается

неясной.

1. Хромосомы

Первичная степень укладки молекул ДНК - хромосомная фибрилла. Наблюдения за структурой хроматина с помощью электронного микроскопа показали, что в составе ядра на ультратонких срезах всегда видны фибриллярные элементы. Впервые их обнаружил Х. Рис (1957), который и дал им название элементарных хромосомных фибрилл.

Морфология хромосом

Морфологию хромосом лучше всего изучать в момент их наибольшей конденсации, в метафазе и в начале анафазы. Хромосомы животных и растений в этом состоянии представляют собой палочковидные структуры разной длины с довольно постоянной толщиной, у большей части хромосом удается легко найти зону первичной перетяжки, которая делит хромосому на два плеча. Хромосомы с равными или почти равными плечами называют метацентрическими, с плечами неодинаковой длины - субметацентрическими. Палочковидные хромосомы

с очень коротким, почти незаметным вторым плечом - акроцентрические.

В области первичной перетяжки расположена центромера, или кинетохор. Это пластинчатая структура, имеющая форму диска. Она связана тонкими фибриллами с телом хромосомы в области перетяжки. От него отрастают пучки микротрубочки митотического веретена, идущие в направлении к центриолям. Они принимают участие в движении хромосом к полюсам клетки при митозе. Обычно одна хромосома имеет только одну центромеру (моноцентрические хромосомы), но могут встречаться хромосомы дицентрические и полицентрические. Некоторые хромосомы имеют вторичную перетяжку. Последняя обычно расположена вблизи дистального конца хромосомы и отделяет маленький участок, спутник. Вторичные перетяжки называют, кроме того, ядрышковыми организаторами, так как именно на этих участках хромосом в интерфазе

происходит образование ядрышка. Здесь же локализована ДНК, ответственная за синтез рРНК. Плечи хромосом оканчиваются теломерами, конечными участками. Теломерные концы хромосом не способны соединяться с другими хромосомами или их фрагментами, в отличие от концов хромосом, лишенных теломерных участков, которые могут присоединяться к таким же разорванным концам других хромосом.

Размеры хромосом у разных организмов варьируют в широких пределах. Так, длина хромосом может колебаться от 0,2 до 50 мкм. Самые мелкие хромосомы обнаруживаются у некоторых простейших, грибов. Наиболее длинные – у некоторых прямокрылых насекомых, у амфибий и у лилейных. Длина хромосом человека находится в пределах 1,5-10 мкм.

Число хромосом у различных объектов тоже значительно колеблется, но

характерно для каждого вида. У некоторых радиолярий число хромосом

достигает 1000-1600. Рекордсменом среди растений по числу хромосом (около500) является папоротник ужовник, 308 хромосом у тутового дерева, у речногорака 196 хромосом. Наименьшее количество хромосом (2 на диплоидный набор) наблюдается у одной из рас аскариды, у сложноцветного Haplopappus gracilic- всего 4 хромосомы (2 пары). Совокупность числа, величины, величины и морфологии хромосом называется кариотипом данного вида. Даже у близких видов хромосомные наборы отличаются друг от друга или по числу хромосом, или по величине хотя бы одной или нескольких хромосом. Следовательно, структура кариотипа может быть таксономическим признаком.

1. Ядрышко

Практически во всех живых клетках эукариотических организмов в ядре видно одно или несколько обычно округлой формы тельц, сильно преломляющих свет, - это ядрышки, или нуклеолы. Ядрышко - не самостоятельная структура или органоид. Оно – производное хромосомы, один из ее локусов, активно функционирующий в интерфазе. В процессах синтеза клеточных белков ядрышко клетки является местом образования рибосомных РНК и рибосом, на которых происходит синтез полипептидных цепей. Ядрышко находится внутри ядра, и не имеет собственной мембранной оболочки, однако хорошо различимо под световым и электронным микроскопом . Основной функцией ядрышка является синтез рибосом . В геноме клетки имеются специальные участки, так называемые ядрышковые организаторы, содержащие гены рибосомной РНК (рРНК) , вокруг которых и формируются ядрышки. В ядрышке происходит синтез рРНК РНК полимеразой I , ее созревание, сборка рибосомных субчастиц. В ядрышке локализуются белки, принимающие участие в этих процессах. Некоторые из этих белков имеют специальную последовательность — сигнал ядрышковой локализации (NoLS, от англ. Nucleolus Localization Signal). Следует отметить, самая высокая концентрация белка в клетке наблюдается именно в ядрышке. В этих структурах было локализовано около 600 видов различных белков, причем считается, что лишь небольшая их часть действительно необходима для осуществления ядрышковых функций, а остальные попадают туда неспецифически.

1. Количество ядрышек в клетке

Начиная с зеленых водорослей, грибов и низших простейших и кончая высшими организмами, все клетки имеют обязательные внутриядерные структуры - ядрышки. Это правило имеет большое число исключений, которые только подчеркивают важность и необходимость ядрышка в жизненном цикле клетки. К таким исключениям относятся клетки дробящихся яиц, где ядрышки отсутствуют на ранних этапах эмбриогенеза, или клетки закончившие развитие и необратимо специализировавшиеся, например, некоторые клетки крови. Количество ядрышек в клетке может меняться, однако их число на ядро зависит от генного баланса клетки. Было найдено, что в образовании ядрышек участвуют определенные места некоторых хромосом, связь которых с ядрышком можно хорошо проследить в телофазе и профазе. Такие хромосомы, как правило, имеют вторичные перетяжки, зоны которых представляют собой места, где идет развитие ядрышек. Мак Клинток (1934) назвал эти участки хромосом “ядрышковыми организаторами”. Места вторичных перетяжек особенно характерны для расположения ядрышковых организаторов, но последние иногда могут находиться на концах хромосом или в нескольких местах по длине хромосомы. Общее число ядрышек на ядро определяется числом ядрышковых организаторов

и увеличивается согласно плоидности ядра. Однако часто количество ядрышек на ядро бывает меньше числа ядрышковых организаторов. Было показано, что ядрышки могут сливаться; кроме того, в образовании одного ядрышка иногда участвует несколько организаторов.

Еще в работах М.С.Навашина (1934) было показано, что хромосомный локус, который в нормальных условиях образует крупное ядрышко, становится неактивным, когда после гибридизации в ядре появляется более “сильный” локус на другой хромосоме. Тот факт, что в определенных условиях может подавляться активность одних ядрышковых организаторов или же повышаться активность других, бывших до этого в латентном, скрытом состоянии, указывает на то, что в клетках поддерживается определенный баланс количества ядрышкового материала или, другими словами, регулируется “валовая” продукция, выдаваемая ядрышками.

Исходя из перечисленных выше фактов, можно сделать следующие заключения:

Образования ядрышек и их число связаны с активностью определенных

участков хромосом - ядрышковых организаторов, которые расположены

большей частью в зонах вторичных перетяжек;

Изменения в числе ядрышек в клетках данного типа могут происходить за счет слияния ядрышек или за счет сдвигов в хромосомном балансе клетки.

1. Физиология и химия ядрышка

Ядрышко по сравнению с другими компонентами клетки характеризуется как самая плотная структура с наиболее высокой концентрацией РНК, с чрезвычайно высокой активностью в отношении синтеза РНК. Концентрация РНК в ядрышках всегда выше концентрации РНК в других компонентах клетки, так концентрация РНК в ядрышке может быть в 2-8 раз выше, чем в ядре, и в 1-3 раза выше, чем в цитоплазме. Отношение концентрации РНК в ядре, ядрышке и цитоплазме клеток печени мыши составляет 1:7,3:4,1, в клетках поджелудочной железы - 1:9,6:6,6. В ядрышке не обнаруживается ДНК, но все же при исследовании фиксированных клеток вокруг ядрышка всегда выделяется зона хроматина. Этот околоядрышковый хроматин, по данным электронной микроскопии, представляется, как интегральная часть сложной структуры ядрышка. Ядрышко - одно из самых активных мест в клетке по включению предшественников в РНК. Ядрышковая РНК является предшественником цитоплазматической РНК. Цитоплазматическая РНК синтезируется в ядрышке.

1. РНК ядрышек

Оценивая общее содержание в ядрышковых фракциях белков, РНК и ДНК, можно видеть, что на долю РНК приходится около 10% всей массы ядрышка. Так как основную массу цитоплазматической РНК составляет рибосомная РНК, то можно сказать, что ядрышковая РНК принадлежит к этому классу. Подтверждением представлений того, что именно ядрышко является местом синтеза рРНК и образования рибосом, послужило то, что из ядрышковых препаратов были выделены РНП-частицы, которые как по составу РНК (по седиментационным свойствам), так и по размеру можно охарактиризовать как рибосомы или их предшественники с различными коэффициентами седиментации.

1. ДНК ядрышек

Биохимическими исследованиями обнаружено в выделенных ядрышках определенное количество ДНК, которую можно отождествить с околоядрышковым хроматином или с ядрышковыми организаторами хромосом. Содержание ДНК в выделенных ядрышках - 5-12% от сухого веса и 6-17% от всей ДНК ядра. ДНК ядрышкового организатора - это та самая ДНК, на которой происходит синтез ядрышковой, т.е. рибосомной, РНК. Таким образом из биохимических работ появились представления о том, что в ядрышке на ДНК локализованы многочисленные одинаковые гены для синтеза рРНК. Синтез рРНК идет путем образования огромного предшественника и дальнейшего его превращения (созревания) в более короткие молекулы РНК для большой и малой субъедениц рибосом. Изучая ядрышки ооцитов тритонов, исследователи столкнулись с интересным явлением - сверхчисленностью ядрышек. У X. laevis во время роста ооцита появляется до 1000 мелких ядрышек, не связанных с хромосомами. Именно эти ядрышки выделил О.Миллер. вместе с этим на ядро ооцита увеличивается количество рДНК. Это явление получило название амплификации. Оно заключается в том, что происходит сверхрепликация зоны ядрышкового организатора, многочисленные копии отходят от хромосом и становятся дополнительно работающими ядрышками. Такой процесс необходим для накопления огромного (1012) количества рибосом на яйцевую клетку, что обеспечит в будущем развитие эмбриона на ранних стадиях даже при отсутствии синтеза новых рибосом. Сверхчисленные ядрышки после созревания яйцевой клетки исчезают.

1. Ультраструктура ядрышек

При изучении большого числа различных клеток животных и растений отмечена волокнистая или сетчатая структура ядрышек, заключенная в более или менее плотную диффузную массу. Были предложены названия для этих частей: волокнистая часть - нуклеонема и диффузная, гомогенная часть – аморфное вещество, или аморфная часть. Сделанные почти одновременно с этим электронно-микроскопичес-кие исследования также выявили волокнисто-нитчатоестроение ядрышек.

Однако такое нитчатое строение ядрышка не всегда четко выражено. У

некоторых клеток отдельные нити нуклеонем сливаются, и ядрышки могут быть совершенно однородными. При более пристальном изучении ядрышка можно заметить, что основные структурные компоненты ядрышка - плотные гранулы диаметром около 15 нм и тонкие фибриллы толщиной 4-8 нм. Во многих случаях (ооциты рыб и амфибий, меристематические клетки растений) фибриллярный компонент собран в плотную центральную зону (сердцевина), лишенную гранул, а гранулы занимают переферическую зону ядрышка. В ряде случаев (например, клетки корешков растений) в этой гранулярной зоне не наблюдается никакой дополнительной структуризации. Было найдено, что аморфные участки ядрышек неоднородны. В их структуре выявляются малоокрашенные зоны - фибриллярные центры - и окружающие их более темные участки, тоже имеющие фибриллярное строение. Кроме этих двух компонентов ядрышек в последнее время большое внимание уделялось строению околоядрышкового хроматина. Этот хроматин и внутриядрышковая сеть ДНК являются единой системой и представляют собой интегральный компонент ядрышка. Гранулы и фибриллярная часть состоят из рибонуклеопротеидов. Показано, что именно светлые фибриллярные центры содержат рДНК.

1. Судьба ядрышка при делении клеток

Известно, что ядрышко исчезает в профазе и появляется вновь в средней телофазе. По мере затухания синтеза рРНК в средней профазе происходит разрыхление ядрышка и выход готовых рибосом в кариоплазму, а затем и в цитоплазму. При конденсации профазных хромосом фибриллярный компонент ядрышка и часть гранул тесно ассоциируют с их поверхностью, образуя основу матрикса митотических хромосом. Этот фибриллярно-гранулярный материал, синтезированный до митоза, переносится хромосомами в дочерние клетки. В ранней телофазе по мере деконденсации хромосом происходит высвобождение компонентов матрикса. Его фибриллярная часть начинает собираться в мелкие многочисленные ассоциаты - предъядрышки, которые могут объединяться друг с другом. По мере возобновления синтеза РНК предъядрышки претерпевают перестройку, что выражается в появлении в их структуре гранул РНК, а затем в становлении дефинитивной формы нормально функционирующего ядрышка.

1. К ариоплазма

Клетки всех организмов имеют единый план строения, в котором четко проявляется общность всех процессов жизнедеятельности. Каждая клетка включает в свой состав две неразрывно связанные части: цитоплазму и ядро. Как цитоплазма, так и ядро характеризуются сложностью и строгой упорядоченностью строения, и, в свою очередь, в состав их входит множество разнообразных структурных единиц, выполняющих совершенно определенные функции. Кариоплазма (ядерный сок, нуклеоплазма) в виде неструктурированной массы окружает хромосомы и ядрышки. Вязкость ядерного сока примерно такая же, как вязкость основного вещества цитоплазмы. Кислотность ядерного сока, определенная путем микроинъекции индикаторов в ядро, оказалась несколько выше, чем у цитоплазмы. Кроме того, в ядерном соке содержатся ферменты, участвующие в синтезе нуклеиновых кислот в ядре, и рибосомы. Ядерный сок не окрашивается основными красителями, поэтому его называют ахроматиновым веществом, или кариолимфой, в отличие от участков, способных окрашиваться, — хроматина. Кариоплазма — основная внутренняя среда ядра, она занимает все пространство между ядрышком, хроматином, мембранами, всевозможными включениями и другими структурами. Кариоплазма под электронным микроскопом имеет вид гомогенной или мелкозернистой массы с низкой электронной плотностью. В ней во взвешенном состоянии находятся рибосомы, микротельца, глобулины и различные продукты метаболизма. Кариоплазма характеризуется особыми структурными и функциональными свойствами. Функции кариоплазмы чрезвычайно многообразны, поскольку с ней связаны коллоидные свойства ядра, а также явления роста, синтеза ДНК, различных РНК и белка, передачи раздражения и т. п. Физико-химические свойства кариоплазмы обусловлены ее коллоидным характером. Они определяются наличием в ней множества частиц, в совокупности образующих огромную поверхность взаимодействия со средой, что обеспечивает прохождение разнообразных физико-химических процессов.
Благодаря силе поверхностного натяжения, возникающей на микроскопическом комочке кариоплазмы, осуществляется процесс адсорбции — концентрации одного вещества на поверхности другого. В зависимости от увеличения, даваемого микроскопом, кариоплазма представляется гомогенной или зернистой, гранулированной. Размер гранул близок к размеру макромолекул. Вязкость кариоплазмы, измеряемая сантипаузами, может существенно изменяться под действием внешних или внутренних факторов (за единицу измерения принята вязкость воды при температуре 20 град.). Вязкость кариоплазмы, измеряемая сантипуазами, может существенно изменяться под действием внешних или внутренних факторов (за единицу измерения принята вязкость воды при температуре 20 град.). Вязкость кариоплазмы растительной клетки достигает 3-4 сП. В частности, она зависит от температуры и концентрации: гипотонические растворы вызывают ее понижение, гипертонические — повышение. В процессе митотического деления клетки ее вязкость непрерывно возрастает. Кариоплазма - наименее плотная часть ядра, в то время как мембранные системы имеют более плотную структуру. Плотность кариоплазмы колеблется в пределах от 1,025 до 1,055. Химический состав ее крайне сложен и представлен органическими и неорганическими веществами. Основные органические вещества — это белки, углеводы, дезоксирибонуклеиновые и рибонуклеиновые кислоты, жироподобные вещества (липиды).
Из простых белков (протеинов) в кариоплазме содержатся гистоны, протамины, альбумины и глобулины, а из протеидов — липопротеиды, глюкопротеиды и нуклеопротеиды. Большая часть белков относится к глобулярным, меньшая — к фибриллярным структурам. Белки глобулярной формы, способные превращаться в фибриллярные, называются структурными.
Для исследования ультраструктуры ядра используют метод, основанный на гомогенизации ткани или разрушении ядерных стенок и последующем разделении субъядерных структур (фракционирование). В ней основными являются ферменты, принимающие участие в процессах активизации аминокислот при синтезе белка. К этой же фракции относятся ферменты, катализирующие многие реакции, нуждающиеся в энергии АТФ.
Из неорганических веществ в кариоплазме обычно содержится большое количество воды (80-85 %), играющей важную роль в жизнедеятельности как ядра, так и клетки. Вода кариоплазмы может находиться в свободном состоянии (в виде растворителя) и быть связанной водородными связями с полярными группами белковых молекул.
Другие неорганические вещества кариоплазмы содержатся в виде солей, ионов или в соединении с белками, аминокислотами, углеводами и липидами. Наибольшее значение в построении кариоплазмы имеют элементы — кальций, фосфор, калий и сера. На кариоплазму приходится примерно 20 % массы ядра. Кроме широко распространенных элементов (С, О, Н, N, К, Са, Mg, Р, S, Fe, Na, Cl), в клетках некоторых организмов встречаются Li, Ва, Cu, Zn, Si, F, Сг, Br, J, Ag. Несмотря на то что многие из них содержатся в очень небольших количествах, они необходимы для правильного функционирования ядра и клетки. Предполагается, что ионы металлов выполняют роль кофакторов ядерных ферментов, факторов проницаемости и переноса веществ через мембрану и оболочку, комплексообразователей неорганического компонента самой кариоплазмы, поддерживающего определенную ионную силу жидкой фазы. Однако функция каждого из этих металлов строго специфична. Этим объясняется значение микроэлементов в жизнедеятельности организмов.

1. Роль ядра

Ядро осуществляет две группы общих функций: одну, связанную собственно с хранением генетической информации, другую - с ее реализацией, с обеспечением синтеза белка. В первую группу входят процессы, связанные с поддержанием наследственной информации в виде неизменной структуры ДНК. Эти процессы связаны с наличием так называемых репарационных ферментов, ликвидирующих спонтанные

повреждения молекулы ДНК (разрыв одной из цепей ДНК, часть радиационных повреждений), что сохраняет строение молекул ДНК практически неизменным в ряду поколений клеток или организмов. Далее, в ядре происходит воспроизведение или редупликация молекул ДНК, что дает возможность двум клеткам получить совершенно одинаковые и в качественном и в количественном смысле объемы генетической информации. В ядрах происходят процессы изменения и рекомбинации генетического материала, что наблюдается во время мейоза (кроссинговер). Наконец, ядра непосредственно участвуют в процессах

распределения молекул ДНК при делении клеток. Другой группой клеточных процессов, обеспечивающихся активностью ядра, является создание собственно аппарата белкового синтеза. Это не только синтез, транскрипция на молекулах ДНК разных информационных РНК и рибосомных РНК. В ядре эукариотов происходит также образование субъедениц рибосом путем комплексирования синтезированных в ядрышке рибосомных РНК с рибосомными белками, которые синтезируются в цитоплазме и переносятся в ядро.

Таким образом, ядро представляет собой не только вместилище генетического материала, но и место, где этот материал функционирует и воспроизводится. Поэтому выпадение лил нарушение любой из перечисленных выше функций губительно для клетки в целом. Так нарушение репарационных процессов будет приводить к изменению первичной структуры ДНК и автоматически к изменению структуры белков, что непременно скажется на их специфической активности, которая может просто исчезнуть или измениться так, что не будет обеспечивать клеточные функции, в результате чего клетка погибает. Нарушения редупликации ДНК приведут к остановке размножения клеток или к появлению клеток с неполноценным набором генетической информации, что также губительно для клеток. К такому же результату приведет нарушение процессов распределения генетического материала (молекул ДНК) при делении клеток. Выпадение в результате поражения ядра или в случае нарушений каких-либо регуляторных процессов синтеза любой формы РНК автоматически приведет к остановке синтеза белка в клетке или к грубым его нарушениям. Значение ядра как хранилища генетического материала и его главная роль в определении фенотипических признаков были установлены давно. Немецкий биолог Хаммерлинг одним из первых продемонстрировал важнейшую роль ядра. Он выбрал в качестве объекта своих экспериментов необычайно крупную

одноклеточную (или неклеточную) морскую водоросль Acetabularia. Существует два близко родственных вида A. medierranea и A. crenulata, различающихся только по форме “шляпки”. В ряде экспериментов, в том числе таких, в которых “шляпку” отделяли от нижней части “стебелька” (где находится ядро), Хаммерлинг показал, что для нормального развития шляпки необходимо ядро. В дальнейших экспериментах, в которых соединяли нижнюю часть, содержащую ядро одного вида с лишенным ядра стебельком другого вида, у таких химер всегда развивалась шляпка, типичная для того вида, которому принадлежит ядро. При оценке этой модели ядерного контроля следует, однако, учитывать примитивность организма, использованного в качестве объекта. Метод пересадок был применен позднее в экспериментах, проведенных в 1952 г. двумя американскими исследователями, Бриггсом и Кингом, с клетками лягушки Rana pipenis. Эти авторы удаляли из неоплодотворенных яйцеклеток ядра и заменяли их ядрами из клеток поздней бластулы, уже проявлявших признаки дифференцировки. Во многих случаях из яиц реципиентов развивались нормальные взрослые лягушки.

Заключение:

Ядро (лат. nucleus ) — это один из структурных компонентов эукариотической клетки , содержащий генетическую информацию (молекулы ДНК ), осуществляющий основные функции: хранение, передача и реализация наследственной информации с обеспечением синтеза белка . Ядро состоит из хромати́на , я́дрышка , кариопла́змы (или нуклеоплазмы) и ядерной оболочки. В клеточном ядре происходит репликация (или редуплика́ция) — удвоение молекул ДНК, а также транскрипция — синтез молекул РНК на молекуле ДНК. Синтезированные в ядре молекулы РНК модифицируются, после чего выходят в цитоплазму . Образование обеих субъединиц рибосом происходит в специальных образованиях клеточного ядра — ядрышках . Таким образом, ядро клетки является не только вместилищем генетической информации, но и местом, где этот материал функционирует и воспроизводится.

Список литературы:

1. Ченцов Ю.С., Поляков В.Ю. “Ультраструктура клеточного ядра”. М., Наука,

1974

1. Зегнбуш П. “Молекулярная и клеточная биология”. М., Мир, т.1,2, 1982
2. Ленинджер А. Л. Основы биохимии. В 3 Т. М.: Мир, 1985. 1056 с.
3. Решетников В. Н. Клеточные ядра высших растений. Состав, структура, функции. Минск: Навука i тэхнiка, 1992. 88 с.
4. Харрис Г. Ядро и цитоплазма. М.: Мир, 1973. 192 с.
5. Davis L.I. The nuclear pore complex // Annu. Rev. Biochem. 1995. V. 64. P. 865-896.
6. Ryan K. J. and Wente S.R. The nuclear pore complex: a protein machine bridging the nucleus and cytoplasm.// Curr.Opin. Cell Biol.. 2000. C.12.P.361-371.

При подготовке реферата были использованы материалы, полученные из Всемирной Биологической Сети (BIOSCI) посредством сети Internet.

31

Ядерная оболочка клеток млекопитающих содержит 3-4 тысячи пор (примерно 10 пор на 1 квадратный мкм). Через ядерные поры происходит обмен веществами между ядром и цитоплазмой. Действительно, РНК, синтезируемые в ядре, а также рибосомные субъединицы и белки, содержащие сигналы ядерного экспорта, транспортируются через ядерные поры в цитоплазму, а гистоны, компоненты репликативной системы, многие другие белки импортируются через ядерные поры из цитоплазмы в ядро. Поры окружены большими кольцевыми структурами, называемыми поровыми комплексами (их внутренний диаметр составляет приблизительно 80 нм, а мол. масса -50-100 млн. Каждый комплекс образован набором больших белковых гранул, сгруппированных в октагональную структуру. Поровой комплекс пронизывает двойную мембрану, связывая по окружности поры липидный бислой внутренней и внешней мембран в единое целое. "Дыра" в центре каждого комплекса (ядерная пора) представляет собой водный канал, сквозь который водорастворимые молекулы курсируют между ядром и цитоплазмой. Ядерный поровой комплекс содержит заполненный водой цилиндрический канал диаметром около 9 нм. Большие ядерные белки взаимодействуют с белками-рецепторами, расположенными на границе ядерных пор, и эти рецепторы активно переносят белки в ядро, увеличивая канал поры.

Количество ядерных пор зависит от типа клетки, стадии клеточного цикла и конкретной гормональной ситуации. Для ядерной поры характерна симметрия восьмого порядка, поэтому многие белки ядерной поры представлены в ее составе в количестве, кратном восьми. В электронный микроскоп видны выпуклые кольца. Кольцо, находящееся с ядерной стороны, несет структуру, называемую корзиной (basket). Это образование состоит из обращенных в нуклеоплазму фибрилл и прикрепленного к ним терминального кольца. К просвету канала обращены восемь симметричных образований (spoke complex). В центре комплекса виден вход в канал ядерной поры. Иногда в канале оказывается видна электронноплотная гранула. Некоторые исследователи полагают, что это какой-то транспортирующийся комплекс в момент пересечения ядерной мембраны. Другие считают, что эта структура является функциональной деталью ядерной поры. На основании этого последнего предположения была даже выдвинута не подтвердившаяся впоследствии гипотеза, согласно которой ядерная пора содержит не один, а восемь проницаемых каналов. Молекулы массой менее 5 кДа, проходят через ядерную пору свободно, и равновесие между ядерной и цитоплазматической концентрацией устанавливается за секунды. Для белков массой 17 кДа этот процесс занимает 2 минуты, белков массой 44 кДа (приблизительно 6 нм) - 30 минут. Белки массой более 60 кДа, по-видимому, вообще не могут пассивно проходить через ядерные поры. Проницаемый для гидрофильных макромолекул канал, через который происходит как активный, так и пассивный транспорт, в ядерной поре один, и он, по всей видимости, расположен в центре комплекса. Существуют специальные механизмы транспорта макромолекул внутрь ядра и из ядра в цитоплазму, однако до сих пор о них мало что известно.

Статьи и публикации:

Секвенирование ДНК
Для определения нуклеотидной последовательности в ДНК были разработаны два метода: 1. Метод с использованием "минус- и плюс"-систем ("минус-плюс"-метод, метод Сенгера). 2. Метод с использованием диметилсульфата и гид...

Естественный отбор
Генетическая структура (генофонд как система) популяции, имеющая соответствующую норму реакции особей и обусловливающая фенотипические особенности, влияющие на популяционную структуру и, в итоге, определяют ее приспособленность к конкретн...

Питание
Питание человека – это процесс доставки и усвоения питательных веществ в организм для обеспечения его энергетических и пластических потребностей, а также потребностей в воде, витаминах, минеральных веществах. Кроме этого питание, удовлетв...

Повреждение компонентов биологических мембран при пато­логических процессах. Биологические мембраны наряду с элемента­ми цитоскелета формируют ультраструктуру протоплазмы. Кроме того, они выполняют множество функций, нарушение любой из которых может привести к изменению жизнедеятельности клетки в целом и даже к ее ги­бели. На рис. 2.5 дано схематическое изображение типичной мембраны с указанием тех ее элементов, повреждение которых может наблюдаться при патологии и лежать в основе развития различных заболеваний.
Наиболее тяжелые последствия вызывает повреждение липидного слоя мембран (рис. 2.5, 1), называемого также липидным бислоем, так как он образован двумя слоями липидных молекул (рис. 2.5, 2). Липид­ный бислой клеточной и внутриклеточных мембран выполняет две основ­ные функции - барьерную и матричную (структурную). В нормально фун­кционирующей клетке срединная часть липидного бислоя представляет собой сплошную пленку, образованную углеводородными «хвостами» фосфолипидных молекул. Эта пленка, по свойствам близкая к расплав­ленному парафину, практически непроницаема для ионов и молекул во-

Рис. 2.5. Общая схема строения биологических мембран. Объяснения в тексте.
дорастворимых веществ, таких, как углеводы, аминокислоты, белки, нук­леотиды и нуклеиновые кислоты. Повреждение этого сплошного барьера приводит к нарушению регуляции внутриклеточных процессов и тяжелым расстройствам клеточных функций.
В то же время липидный слой мембран формирует в клетке особую жидкую фазу. На поверхности раздела водной и ли­пидной фаз, а также внутри липидной фазы «плавают» мно­гочисленные ферменты, многие субстраты биохимических реакций, белковые клеточные рецепторы, гликолипиды и гликолипопротеиды, образующие гликокаликс.
Во многих клетках до 80 % белков встроены в мембраны или связа­ны с их поверхностью (рис. 2.5). Липидный бислой выполняет, таким обра­зом, роль структурной основы, или матрицы, для всех белковых, липопротеидных, гликопротеидных и гликолипидных компонентов мембран. От свойств липидной фазы мембран, таких, как вязкость, поверхностный за­ряд, полярность, зависит работа мембранных ферментов и рецепторов.
Для наружных клеточных мембран характерно наличие гликокаликса, образованного гликолипидами и гликопротеидами (рис. 2.5, 3 и 2.5, 4). Гликокаликс выполняет ряд функций, вчастности, от него зависят свой­ства клеточной поверхности, способность клеток к фагоцитозу и адгезии с другими клетками. Гликокаликс эритроцитов препятствует их агглюти­нации. Повреждение гликокаликса приводит к тяжелым последствиям, помимо прочего еще и потому, что это вызывает изменения иммунных свойств клеточной поверхности.
Действие многих токсичных соединений направлено на белковые компоненты клеточной мембраны. Например, цианистый калий блокиру­ет цитохромоксидазу - фермент, входящий в состав внутренних мемб­ран митохондрии. Ионы тяжелых металлов (ртуть, серебро, свинец) свя­зывают БН-группы белков, в том числе мембранных ферментов и ионных каналов (рис. 2.5, 7 и 2.5, 5), вызывая их инактивацию. На белки плазма­тических мембран или элементы цитоскелета (рис. 2.5, 5 и 2.5, 6) направ­лено действие многих бактериальных токсинов. Изменения активности мембранных ферментов, каналов и рецепторных белков, вызванные неблагоприятными факторами, также приводят к нарушению функции кле­ток и развитию заболеваний.
Основные механизмы нарушения барьерных свойств липидно­го слоя. Изучение воздействия разного рода повреждающих агентов на изолированные клетки (например, на эритроциты), митохондрии, фосфо­липидные везикулы (липосомы), плоские бислойные липидные мембра­ны (БЛМ) и другие модельные объекты показало, что в конечном счете существует четыре основных процесса, которые при патологии непосред­ственно обусловливают нарушение целостного липидного бислоя [Вла­димиров Ю.А., 1973]:
- перекисное окисление липидов;
- действие мембранных фосфолипаз;
- механическое (осмотическое) растяжение мембраны;
- адсорбция на бислое полиэлектролитов, включая некоторые белки
и пептиды.
Чтобы понять роль этих процессов в развитии патологического со­стояния, надо знать химические и физические условия протекания каж­дого из них, пути их регуляции в живой клетке и причины ее нарушения, характер повреждения свойств мембран под действием данного процес­са, биологические последствия такого повреждения мембран для жизне­деятельности клетки и организма в целом. Рассмотрим эти вопросы на примере наиболее изученного процесса - перекисного окисления (пероксидации)липидов.
Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов. Перекисное окисление (пероксидация) липидов - пример процесса, идуще­го с участием свободных радикалов. Свободные радикалы - это молеку­лярные частицы, имеющие непарный электрон на внешней орбитали и обладающие высокой реакционной способностью. Их изучение ведется методом ЭПР (спиновые ловушки), хемилюминесценции и путем приме­нения ингибиторов реакций, в которых участвуют радикалы определен­ного типа.
В табл. 2.3 приведен перечень основных типов свободных радика­лов, образующихся в организме человека.
Свободные радикалы, образующиеся в клетках организма

Первичные радикалы. К первичным можно отнести радикалы, об­разующиеся в клетках ферментативным путем, - это радикалы кислоро­да (супероксид и гидроксильный радикал), монооксид азота, радикалы, образующиеся в окислительно-восстановительных реакциях (например, убихинол). Вторичные радикалы образуются при неферментативных ре­акциях ионов железа. Это гидроксил-радикалы и радикалы липидов. Ра­дикалы образуются также при действии ультрафиолетовых лучей и входе метаболизма некоторых чужеродных соединений (ксенобиотиков), в том числе некоторых препаратов, ранее применявшихся в качестве лекарств.
Активные формы кислорода. Основная масса молекулярного кис­лорода, потребляемого клетками нашего организма, непосредственно восстанавливается до воды, окисляя органические субстраты в цепях пе­реноса электронов. Меньшая часть кислорода расходуется на неполное окисление органических соединений. Наконец, заметная часть кислоро­да восстанавливается клетками организма до супероксидного радикала. Так, клетки-фагоциты (моноциты и гранулоциты крови и тканевые макро­фаги) выделяют кислород в реакции, катализируемой ферментным ком­плексом НАДФН-оксидазой:
НАДФН + 202 -> НАД+ + Н+ + 202" (супероксид).
Дальнейшая судьба супероксидных радикалов может быть разной (см. рис. 2.6). В норме и при отсутствие ионов металлов переменной ва-

Рис. 2.6. Метаболизм супероксидного радикала. Объяснения в тексте.
лентности супероксидные радикалы превращаются в перекись водоро­да; эта реакция катализируется ферментом супероксиддисмутазой (ре­акция 2):
2Ю2- -» Н202 + 02
Клетки-фагоциты используют перекись водорода, превращая ее в гипохлорит - соединение, разрушающее стенки бактериальных клеток; эта реакция катализируется ферментом миелопероксидазой (реакция 3):
н2о2 + с1--»н2о + сю-.
Избыток перекиси водорода удаляется под действием двух фермен­тов: глутатион-пероксидазы или каталазы (4 на рис. 2.6):
Н202 + гвБН (глутатион) -> Глутатионпероксидаза 2Н20 + ОББО;
2Н202 -» Каталаза 2Н20 + 02.
Радикал гидроксила. В условиях патологии могут произойти нару­шения либо системы защитных ферментов (в частности, снижение актив­ности СОД), либо ферментных систем, связывающих ионы железа в плаз­ме крови (церулоплазмин и трансферрин) и в клетках (ферритин). В этом случае супероксидные радикалы и перекись водорода вступают в альтер­нативные реакции:
1. образование двухвалентного железа из трехвалентного (рис. 2.6, 7):
Ре3+ + Ю2- -» Ре2+ + 02;
2. реакция перекиси водорода и гипохлорита с ионами двухвалентно­го железа (рис. 2.6, 9 и 10):
Ре2+ + Н202 -» 1=е3+ + НО" + НО* (реакция Фентон);
Ре2+ + СЮ- + Н+ -» Ре3+ + С1" + НО- (реакция Осипова).

Совокупность продуктов, образуемых активированными клетками-фагоцитами (радикалы супероксида и гидроксила, перекись водорода и гипохлорит), называют активными формами кислорода; некоторые авто­ры называют гипохлорит и продукты его метаболизма в тканях (такие, как хлорамины Р-ЫНС1), активными формами хлора.
Радикалы гидроксила химически исключительно активны и вызыва­ют повреждение белков, нуклеиновых кислот и липидов биологических мембран. Особенно тяжелые последствия имеют две последние реакции. Радикалы -ОН вызывают разрыв нитей ДНК, оказывают в зависимости от ситуации, мутагенное, канцерогенное или цитостатическое действие. Вместе с тем, реагируя с ненасыщенными жирными кислотами, входя­щими в состав мембранных липидов, радикалы гидроксила инициируют цепную реакцию их пероксидации (перекисного окисления).
Цепное окисление липидов. Реакция цепного окисления липидов играет исключительную роль в клеточной патологии. Она протекает в не­сколько стадий, которые получили название инициирование, продолже­ние, разветвление и обрыв цепи (рис. 2.7). Рассмотрим эти стадии под­робнее.


Рис. 2.7. Реакция цепного окисления липидов.
А - реакция с неразветвленной цепью, Б - разветвленная цепная реакция
Инициирование цепи. Радикал гидроксила - небольшая по разме­ру незаряженная частица - способен проникать в толщу гидрофобного липидного слоя и вступать в химическое взаимодействие с полиненасы­щенными жирными кислотами (которые принято обозначать как Ш), вхо­дящими в состав биологических мембран и липопротеинов плазмы кро­ви. При этом в липидном слое мембран образуются липидные радикалы:
НО- + Ш -» Н20 + Ь.

Липидный радикал (L-) вступает в реакцию с растворенным в среде молекулярным кислородом; при этом образуется новый свободный ра­дикал - радикал липоперекиси (LOO):
L- + LH -> LOO .
Продолжение цепи. Этот радикал атакует одну из соседних моле­кул фосфолипида с образованием гидроперекиси липида LOOH и нового радикала
LOO + LH-»LOOH + L-.
Чередование двух последних реакций представляет собой цепную реакцию перекисного окисления липидов (см. рис. 2.7, А).
Разветвление цепи. Существенное ускорение пероксидации ли­пидов наблюдается в присутствии небольших количеств ионов двухвален­тного железа. В этом случае происходит разветвление цепей в результа­те взаимодействия Fe с гидроперекисями липидов:
Fe2+ + LOOH -> Fe3+ + НО- + LO.
Образующиеся радикалы LO* инициируют новые цепи окисления липидов (рис. 2.7, Б):
LO + LH -> LOH + L-; L- + 02 -> LOO- -> и т.д.
Обрыв цепей. В биологических мембранах цепи могут состоять из десятка и более звеньев. Но в конце концов цепь обрывается в результа­те взаимодействия свободных радикалов с антиоксидантами (InH), иона­ми металлов переменной валентности (например, теми же Fe2+) или друг с другом:
LOO- + Fe2+ + H + `LOOH;
LOO- + InH -» In-;
LOO- + LOO- -> молекулярные продукты.
Использование хемилюминесценции для изучения реакций, идущих с участием свободных радикалов. Последняя реакция интерес­на еще и тем, что она сопровождается свечением - хемилюминесценци­ей. Интенсивность хемилюминесценции очень мала, поэтому ее иногда называют «сверхслабым свечением». Интенсивность свечения пропорци­ональна квадрату концентрации свободных радикалов в мембранах, а ско­рость перекисного окисления прямо пропорциональна концентрации тех же радикалов. Поэтому интенсивность «сверхслабого» свечения однознач­но отражает скорость липидной пероксидации в изучаемом биологичес­ком материале, и измерение хемилюминесценции довольно часто исполь­зуется при изучении перекисного окисления липидов в различных объектах.
Измерение хемилюминесценции широко применяется также для изучения образования активных форм кислорода клетками крови и пери­тонеальными макрофагами. В присутствии специальных соединений - люминола и люцигенина - наблюдается хемилюминесценция изолиро­ванных лейкоцитов крови, макрофагов или разведенной цельной крови, если клетки-фагоциты продуцируют гипохлорит, и радикалы кислорода (супероксид + гидроксил-радикал). Интенсивность хемилюминесцентных ответов клеток увеличивается в несколько раз при появлении очагов не­кроза в организме, например после инфаркта миокарда, и, напротив, уг­нетается при тканевой гипоксии; поэтому измерение клеточной хемилю­минесценции может быть использовано в ряде случаев с целью выявления заболевания, оценки тяжести состояния больного и эффективности на­значенного лечения.

Биологические последствия пероксидации липидов. Увеличен­ное образование свободных радикалов в организме и связанное с этим усиление процессов пероксидации липидов (которое иногда называют оксидативным стрессом) сопровождается рядом нарушений в свой­ствах биологических мембран и функционировании клеток. Наиболее изу­чены три прямых следствия перекисного окисления липидов.
Во-первых, перекисное окисление липидов сопровождается окис­лением тиоловых (сульфгидрильных) групп мембранных белков (Рг). Это может происходить в результате неферментативной реакции ЭН-групп со свободными радикалами липидов; при этом образуются сульфгидрильные радикалы, которые затем взаимодействуют собразованием дисуль­фидов либо окисляются кислородом с образованием производных суль­фоновой кислоты:
Рг-ЭН + и -» Ш + Рг-Э-;
Р^-Э- + Рг2-Э- -» Рг^ЭЭ-Р^;
Рг-Э* + 02 -> Рг-Э02` -> молекулярные производные.
Связанные с перекисным окислением липидов окисление белков и образование белковых агрегатов в хрусталике глаза заканчиваются его помутнением; этот процесс имеет большое значение в развитии старчес­кой и других видов катаракты у человека. Важную роль в патологии клетки играет также инактивация ион-транспортных ферментов, в активный центр которых входят тиоловые группы, в первую очередь Са2+-АТФазы. Инак­тивация этого фермента вызывает замедление «откачивания» ионов каль­ция из клетки и, наоборот, вход кальция в клетку (рис. 2.8, 7), увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция и повреждение клетки.

size=3 face="Times New Roman">

Рис. 2.8. Нарушение барьерных свойств мембран при перекисном окислении липидов.

Наконец, окисление тиоловых групп мембранных белков приводит к появлению дефектов в липидном слое мембран клеток и митохондрий. Под действием разности электрических потенциалов на мембранах через такие дефекты в клетки входят ионы натрия, а в митохондрий - ионы калия. В результате увеличивается осмотическое давление внутри клеток и митохондрий, что способствует еще большему повреждению мембран.
Во-вторых, результат перекисного окисления липидов связан с тем, что продукты пероксидации обладают способностью непосредственно увеличивать ионную проницаемость липидного бислоя. Показано, что продукты перекисного окисления липидов делают липидную фазу мемб­ран проницаемой для ионов водорода (рис. 2.8, 2) и кальция (рис. 2.8, 3). Это приводит к тому, что в митохондриях окисление и фосфорилирова­ние разобщаются, а клетка оказывается в условиях энергетического голода (т.е. недостатка АТФ). Одновременно в цитоплазму выходят ионы кальция, которые повреждают клеточные структуры.
Третьий (и быть может, самый важный) результат пероксидации - это уменьшение стабильности липидного слоя, что может вызвать элект­рический пробой мембраны собственным мембранным потенциалом, т.е. под действием разности электрических потенциалов, существующей на мембранах живой клетки. Электрический пробой приводит к полной по­тере мембраной ее барьерных функций (рис. 2.8, 4).
Клеточные системы антирадикальной защиты. В нормальных условиях процесс перекисного окисления липидов находится под стро­гим контролем ферментативных и неферментативных систем клетки, от­чего скорость его невелика. Принято делить химические соединения и физические воздействия, влияющие на скорость перекисного окисления липидов, на прооксиданты (усиливают процессы перекисного окисления) и антиоксиданты (тормозят перекисное окисление липидов). К проокси­дантам в живой клетке относятся высокие концентрации кислорода (на­пример, при длительной гипербарической оксигенации больного), фер­ментные системы, генерирующие супероксидные радикалы (например, ксантиноксидаза, ферменты плазматической мембраны фагоцитов и др.), ионы двухвалентного железа.
Хотя сам процесс перекисного окисления развивается в виде цеп­ных реакций в липидной фазе мембран и липопротеинов, начальные (а) стадии этой сложной системы реакций про­текают в водной фазе. Часть защитных систем клетки также локализуется в липидной, а часть - в водной фазах. В зависимости от этого можно го­ворить о водорастворимых и гидрофобных антиоксидантах.
Антиоксиданты водной фазы. Основные реакции в водной фазе, предшествующие цепному окислению, и роль антиоксидантов в ограни­чении скорости этих процессов можно представить в виде схемы:

Непосредственными предшественниками гидроксильного радика­ла, инициирующего цепное окисление липидов, служат ионы двухвалент­ного железа и перекись водорода (или образующийся из нее гипохлорит). По этой причине образование радикала гидроксила и пероксидация ли­пидов тормозятся веществами, снижающими концентрацию одного из этих двух соединений. К ним относятся следующие вещества:
- фермент супероксиддисмутаза - снижает концентрацию суперок­сидных радикалов и тем самым препятствует восстановлению ими ионов трехвалентного железа до двухвалентного. В клетке ионы же­леза хранятся в трехвалентном состоянии в специальных депо, об­разованных субъединицами белка - ферритина;
- ферменты каталаза и глутатионпероксидаза - удаляют перекись во­дорода. Эффективность работы глутатионпероксидазы зависит от концентрации свободного глутатиона, при снижении которой может возрастать концентрация цитотоксических гидроксильных ради­калов;
- регенерация восстановленного глутатиона (СБН) из окисленного (СББС) осуществляется за счет НАДФН; этот процесс катализиру­ется ферментом глутатионредуктазой. Недостаток глутатиона в клет­ках, например в эритроцитах, который может быть обусловлен дей­ствием токсичных веществ, например ионов тяжелых металлов или наследственным недостатком глутатионредуктазы, приводит к ак­тивации перекисного окисления; это, в частности, наблюдается при некоторых видах гемолитических анемий;
- соединения, связывающие ионы железа (комплексоны). Следует, однако, добавить, что в водной фазе некоторые комплексы ионов железа вступают в реакции с супероксидным радикалом и перекисью водорода наряду со свободными ионами железа.
Антиоксиданты, тормозящие развитие цепных реакций в ли­пидной фазе. Основные реакции в липидной фазе биологических мемб­ран и липопротеинов крови, а также роль антиоксидантов в ограничении скорости этих процессов можно продемонстрировать с помощью схемы.

Цепные реакции «ведут» свободные радикалы липидов (L* и LOO), разветвление цепей происходит при взаимодействии продукта пероксидации - гидроперекиси липидов (LOOH) с ионами Fe . Все соединения, снижающие концентрацию перечисленных веществ, выполняют функцию антиоксидантов. К ним относятся:
- ферменты фосфолипаза и глутатионпероксидаза, разрушающие гидроперекиси липидов, предотвращая разветвление цепей окис­ления липидов в мембранах. При этом действие фосфолипазы зак­лючается в отщеплении от фосфолипидов окисленной жирной кис­лоты, содержащей гидроперекисную группу (LOOH), а действие глутатионпероксидазы сводится к восстановлению этой группы до спиртовой с одновременным окислением глутатиона (GSH) до ди­сульфида (GSSG):
LOOH + 2GSH -» LOH + GSSG + Н20;
- ловушки радикалов, которые называют иногда «липидными антиоксидантами». По своей химической природе липидные антиок­сиданты - это производные фенола. К ним относится сс-токоферол (витамин Е), убихинон (кофермент Q), тироксин, эстрогены и синте­тические соединения,например ионол;

Соединения, связывающие железо. Большинство из них, включая такие природные соединения, как дипептид карнозин, не просто связывают железо, но, главное, не дают ему возможности приник­нуть в липидную фазу мембран, поскольку образующиеся комплек­сы в силу своей полярности не проникают в гидрофобную зону.
Для детоксикации двухвалентного железа в организме существует, по-видимому, целая система окисления и связывания ионов железа. В плазме крови эта система представлена ферментом церрулоплазмином (феррооксидазой), который окисляет Ре2+ до Ре3+ кислородом без обра­зования свободных радикалов, и белком трансферрином, который свя­зывает и переносит в кровяном русле ионы трехвалентного железа, а за­тем захватывается клетками. В клетках железо может восстанавливаться аскорбиновой кислотой и другими восстановителями, но затем окисля­ется и депонируется в окисленной форме внутри ферментного белкового комплекса ферритина.

Реконструкция ядерной поры.

Ядерные поры - это не просто перфорации, а сложно устроенные, многофункциональные регулируемые структуры, организованные приблизительно 30 белками - нуклеопоринами . Белковая составляющая ядерной поры обозначается термином «комплекс ядерной поры» (англ., nuclear pore complex, NPC). Масса комплекса ядерной поры колеблется в пределах от ~44 МДа в клетках дрожжей до ~125 МДа у позвоночных .

По данным электронной микроскопии , ядерные поры в поперечном сечении имеют форму «восьмиспицевого тележного колеса», то есть имеют ось симметрии восьмого порядка. Эти данные подтверждает тот факт, что молекулы нуклеопоринов присутствуют в составе ядерной поры в количестве, кратном восьми. Проницаемый для молекул канал располагается в центре структуры. Комплекс ядерной поры заякорен на ядерной оболочке с помощью трансмембранной части, от которой к просвету канала обращены структуры, получившие название спиц (англ., spokes), по аналогии со спицами тележного колеса. Эта коровая часть поры, построенная из восьми доменов , с цитоплазматической и ядерной сторон ограничена соответственно цитоплазматическим и ядерным кольцами (англ., rings; у низших эукариот они отсутствуют). К ядерному кольцу прикреплены белковые направленные внутрь ядра тяжи (ядерные филаменты , англ., filaments), к концам которых крепится терминальное кольцо (англ., terminal ring). Вся эта структура носит название ядерной корзины (англ., nuclear basket). К цитоплазматическому кольцу также прикреплены направленные в цитоплазму тяжи - цитоплазматические филаменты . В центре ядерной поры видна электрон-плотная частица, «втулка» или транспортер (англ., plug).

Физические размеры ядерной поры высших эукариот. Вид сверху и сбоку.

Свойства ядерных пор

Количество ядерных пор на одно ядро может колебаться от 190 у дрожжей , 3000-5000 в клетках человека , до 50 млн в зрелых ооцитах шпорцевой лягушки (Xenopus laevis ). Этот показатель может также варьировать в зависимости от типа клетки, гормонального статуса и стадии клеточного цикла . Например, в клетках позвоночных количество ядерных пор удваивается на протяжении S фазы, одновременно с удвоением хромосом . При разборке ядерной оболочки во время митоза ядерные поры позвоночных распадаются на субкомплексы с массами около миллиона дальтон . Показано, что разборка комплекса ядерной поры инициируется циклин B-зависимой киназой , фосфорилирующей нуклеопорины. После завершения клеточного деления ядерные поры собираются de novo . Ядерные поры интерфазного ядра перемещаются большими массивами, а не независимо друг от друга, причем эти перемещения происходят синхронно с перемещениями ядерной ламины . Это служит доказательством того, что ядерные поры механически связаны между собой и формируют единую систему (англ., NPC network).

Нуклеопорины

Нуклепорины, белки из которых постоены ядерные поры, делят на три подгруппы. К первой относят трансмембранные белки, заякоривающие комплекс в ядерной оболочке . Нуклепорины второй группы содержат характерный аминокислотный мотив - несколько раз повторенные FG, FXFG или GLFG - последовательности (так называемые FG-повторы , где F - фенилаланин , G - глицин , L - лейцин , X - любая аминокислота). Функция FG-повторов, по-видимому, заключается в связывании транспортных факторов, необходимых для осуществления ядерно-цитоплазматического транспорта. Белки третьей подгруппы не имеют ни мембранных доменов, ни FG- повторов, наиболее консервативны среди всех нуклеопоринов, их роль, по-видимому, заключается в обеспечении связывания FG-содержащих нуклепоринов с трансмембранными. Нуклеопорины также отличаются по своей мобильности в составе ядерной поры. Некоторые белки связаны с конкретной порой на протяжении всего клеточного цикла , в то время как другие полностью обновляются всего за несколько минут.

Ядерно-цитоплазматический транспорт

Ядерно-цитоплазматическим транспортом называется материальный обмен между ядром и цитоплазмой клетки . Ядерно-цитоплазматический транспорт можно разделить на две категории: активный транспорт , требующий затрат энергии, а также специальных белков-рецепторов , и пассивный транспорт , протекающий путем простой диффузии молекул через канал ядерной поры.

Пассивный транспорт

Молекулы небольших размеров (ионы , метаболиты , мононуклеотиды и т. д.) способны пассивно диффундировать в ядро. Проводимость ядерных пор для молекул разных размеров различна. Белки массой менее 15 кДа быстро проникают в ядро, в то время как для белка массой более 30 кДа на это требуется определенное время. Белковые молекулы массой более 60-70 кДа, по-видимому, вообще не могут пассивно проходить через ядерные поры. Впрочем, пропускная способность ядерных пор для пассивной диффузии может изменяться в зависимости от типа клетки и стадии клеточного цикла.

Активный транспорт

Цикл Ran.
1. Транслокация Ran-ГТФ в цитоплазму в комплексе с транспортинами. 2. Гидролиз ГТФ. Собственная ГФАзная активность Ran активируется цитоплазматическим белком RanGAP. 3. Ran-ГДФ реимпортируется в ядро при участии белка NTF2. 4. ГДФ в активном центре Ran заменяется на ГТФ под действием ядерного белка RCC1 (фактора обмена нуклеотидов).

Пропускная способность ядерной поры для активного транспорта значительно выше. Так рибосомные субчастицы размерами до нескольких мегадальтон транспортируются из ядра в цитоплазму через ядерные поры, и нет никаких оснований предполагать, что процесс транспорта сопровождается частичной разборкой этих субчастиц. Системы активного транспорта обеспечивают весь макромолекулярный обмен между ядром и цитоплазмой. Молекулы РНК, синтезируемые в ядре, поступают через поры в цитоплазму, а в ядро попадают белки участвующие в ядерном метаболизме. Причем одни белки должны поступать в ядро конститутивно (например, гистоны), а другие в ответ на определенные стимулы (например, транскрипционные факторы). У ядерных белков идентифицированы специальные последовательности, отвечающие за их локализацию. Самая распространенная из них, так называемый «классический» сигнал ядерной локализации - NLS (от англ., N uclear L ocalization S ignal), представляет собой один или два участка положительно заряженных аминокислот , аргинина и лизина . Транслокация белков в ядро, в отличие от транслокации в митохондрии и эндоплазматический ретикулум , не сопровождается отщеплением этой сигнальной последовательности и разворачиванием полипептидной цепи. NLS-содержащие белки, как и все другие субстраты систем ядерного транспорта, переносятся в ядро в комплексе со специальными белками - транспортинами или кариоферинами (англ., transportins, karyopherins). Каждый транспортин или комплекс транспортинов для осуществления своей функции должен обладать тремя активностями: во-первых, он должен узнавать и связывать транспортируемый субстрат, во-вторых, заякориваться на ядерной поре, и в-третьих, связывать небольшой белок - GTPазу Ran, относящуюся к семейству Ras-подобных ГТФаз и служащую для сопряжения транспорта с гидролизом ГТФ , что придает процессу необратимость (снабжает его энергией). Собственно акт гидролиза ГТФ осуществляется непосредственно этим белком. Фактор обмена нуклеотидов (англ., G TPase Е xchange F actor, GEF) для Ran, хроматин-связывающй белок RCC1, локализован строго в ядре, а активаторы ГТФазной активности (англ., G TPase A ctivation P rotein, GAP) RanGAP1 и некоторые другие белки - строго в цитоплазме. Эта асимметричная локализация приводит к формированию градиента: в ядре находится преимущественно ГТФ-связанная форма Ran, в цитоплазме, наоборот, ГДФ-связанная. Ran используется для снабжения энергией как процессов импорта, так и процессов экспорта различных субстратов, а вся схема носит название Ran-цикла (англ., Ran-cycle). Ran-цикл снабжает энергией и экспорт, и импорт, используя общий принципиальный механизм, ключевыми стадиями которого являются гидролиз ГТФ в цитоплазме и обмен ГДФ на ГТФ в ядре.

Схема импорта белков в ядро.
1. Образование комплекса груз-рецептор (импортин). 2. Заякоривание комплекса на белках ядерной поры и собственно транслокация. 3. Диссоциация комплекса груз-импортин под воздействием Ran-ГТФ, высвобождение груза, образование комплекса Ran-ГТФ-импортин. 4. Реэкспорт образовавшегося комплекса в цитоплазму. 5. Гидролиз ГТФ и диссоциация комплекса.

Механизм импорта белков в ядро

Рассмотрим механизм поступления субстратов в ядро на примере импорта NLS-содержащих белков. Первой стадией транспортировки является узнавание субстрата транспортинами, в данном случае комплексом импортинов-α/β (транспортины участвующие в транспорте в ядро называются импортинами, а из ядра - экспортинами). Затем образовавшийся комплекс заякоривается на белках ядерной поры с цитоплазматической стороны и транслоцируется через канал в ядро, где с ним связывается Ran-ГТФ, что вызывает диссоциацию комплекса и высвобождение груза. После чего импортины в комплексе с Ran-ГТФ направляются обратно в цитоплазму, где Ran под действием RanGAP1 гидролизует ГТФ (ГТФ => ГДФ + PO 4 3-). Комплекс Ran-ГДФ-импортины α/β нестабилен и диссоциирует. Ran-ГДФ поступает обратно в ядро при помощи собственного переносчика, димерного белка NTF2. В ядре под действием белка RanGEF, ГДФ в активном центре Ran заменяется на ГТФ и цикл, тем самым, замыкается.

Схема экспорта белков из ядра.
1. Образование комплекса груз-экспортин-Ran-ГТФ. 2. Заякоривание комплекса на белках ядерной поры и собственно транслокация. 3. Гидролиз ГТФ, диссоциация комплекса и высвобождение груза. 4. Реимпорт высвободившегося экспортина.

Механизм экспорта белков из ядра

Теперь рассмотрим механизм экспорта из ядра на примере белков, содержащих сигналы ядерного экспорта (англ., N uclear E xport S ignal, NES). Для последовательностей этих сигналов характерно содержание гидрофобных аминокислот. Первой стадией транспортировки здесь также является рецепция субстрата специфическим экспортином Crm1 (англ., C hromosome R egion M aintenance) и образование комплекса. Главным отличием механизмов импорта является тот факт, что в состав транслоцирующегося комплекса в случае экспорта помимо субстрата и Crm1 входит и Ran-ГТФ, то есть сопряжение с циклом Ran происходит на стадии транслокации, а не на стадии реимпорта рецептора. После прохождения через ядерную пору в цитоплазму, Ran расщепляет ГТФ, комплекс теряет стабильность и диссоциирует, высвобождая груз.